Increase of glyoosaminoglycans and metalloprotenases 2 and 9 in liver extracelllular matrix on early stages of extrahepatic cholestaiis / Aumento de glicosaminoglicanos e metaloproteinases 2 e 9 na matriz extracelular de fígado em estágios iniciais de colestase extra-hepática

Context Cholestasis produces hepatocellular injury, leukocyte infiltration, ductular cells proliferation and fibrosis of liver parenchyma by extracellular matrix replacement. Objective Analyze bile duct ligation effect upon glycosaminoglycans content and matrix metalloproteinase (MMPs) activities. Methods Animals (6-8 weeks; n = 40) were euthanized 2, 7 or 14 days after bile duct ligation or Sham-surgery. Disease evolution was analyzed by body and liver weight, seric direct bilirubin, globulins, gamma glutamyl transpeptidase (GGT), alkaline phosphatase (Alk-P), alanine and aspartate aminotransferases (ALT and AST), tissue myeloperoxidase and MMP-9, pro MMP-2 and MMP-2 activities, histopathology and glycosaminoglycans content. Results Cholestasis caused cellular damage with elevation of globulins, GGT, Alk-P, ALT, AST. There was neutrophil infiltration observed by the increasing of myeloperoxidase activity on 7 (P = 0.0064) and 14 (P = 0.0002) groups which leads to the magnification of tissue injuries. Bile duct ligation increased pro-MMP-2 (P = 0.0667), MMP-2 (P = 0.0003) and MMP-9 (P<0.0001) activities on 14 days indicating matrix remodeling and establishment of inflammatory process. Bile duct ligation animals showed an increasing on dermatan sulfate and/or heparan sulfate content reflecting extracellular matrix production and growing mitosis due to parenchyma depletion. Conclusions Cholestasis led to many changes on rats’ liver parenchyma, as so as on its extracellular matrix, with major alterations on MMPs activities and glycosaminoglycans content. .

Contexto Colestase produz lesão hepatocelular, infiltração leucocitária, proliferação de células ductulares e fibrose do parênquima hepático por matriz extracelular. Objetivo Analisar os efeitos da ligação do ducto biliar sobre conteúdo de glicosaminoglicanos e atividade de metaloproteinases de matriz (MMP). Métodos Animais (6-8 semanas; n = 40) foram eutanasiados 2, 7 ou 14 dias após ligação do ducto biliar ou falsa ligação. A evolução da doença foi analisada por peso corporal e do fígado, concentrações séricas de bilirrubina direta, globulinas, gama glutamil transpeptidase (GGT), fosfatase alcalina (Alk-P), alanina e aspartato aminotransfesases (ALT e AST), alterações teciduais de mieloperoxidase e metaloproteinases (MMP-9, pro MMP-2 e MMP-2), histopatologia e conteúdo de glicosaminoglicanos. Resultados A colestase causou dano celular com elevação dos níveis séricos de globulinas, GGT, Alk-P, ALT e AST. Houve também infiltração leucocitária observada pelo aumento na atividade de mieloperoxidase nos grupos 7 (P = 0,0064) e 14 dias (P = 0,0002) o que leva ao aumento das lesões no tecido. Ligação do ducto biliar aumentou as atividades de pro MMP-2 (P = 0,0677), MMP-2 (P = 0,0003) e MMP-9 (P<0,0001) aos 14 dias indicando remodelamento da matriz e estabelecimento de processo inflamatório. Animais com ligação do ducto biliar mostraram um aumento do conteúdo de dermatam sulfato e/ou heparam sulfato refletindo a produção de matriz extracelular e aumento de mitose devido a depleção do parênquima hepático. Conclusões Colestase causou várias mudanças no parênquima hepático de ratos, bem como em sua matriz extracelular, com importantes alterações na atividade ...

Positive correlttion between disease activity idex and matrix metalloproteinasses activity in a rat model of colitis / Correlação positiva entre índice de atividade de doença e metaloproteinase de matriz em modelo de colite em ratos

Context Inflammatory bowel disease, including ulcerative colitis and Crohn’s disease, comprising a broad spectrum of diseases those have in common chronic inflammation of the gastrointestinal tract, histological alterations and an increased activity levels of certain enzymes, such as, metalloproteinases. Objectives Evaluate a possible correlation of disease activity index with the severity of colonic mucosal damage and increased activity of metalloproteinases in a model of ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium. Methods Colitis was induced by oral administration of 5% dextran sulfate sodium for seven days in this group (n=10), whereas control group (n=16) received water. Effects were analyzed daily by disease activity index. In the seventh day, animals were euthanized and hematological measurements, histological changes (hematoxylin and eosin and Alcian Blue staining), myeloperoxidase and metalloproteinase activities (MMP-2 and MMP-9) were determined. Results Dextran sulfate sodium group showed elevated disease activity index and reduced hematological parameters. Induction of colitis caused tissue injury with loss of mucin and increased myeloperoxidase (P<0.001) and MMP-9 activities (45 fold) compared to the control group. Conclusions In this study, we observed a disease activity index correlation with the degree of histopathological changes after induction of colitis, and this result may be related mainly to the increased activity of MMP-9 and mieloperoxidase. .

Contexto Doenças inflamatórias intestinais, entre elas colite ulcerativa e doença de Crohn, compreendem um amplo espectro de doenças que apresentam em comum inflamação crônica do trato gastrointestinal, alterações histológicas e um aumento de atividade de determinadas enzimas, tais como, metaloproteinases. Objetivos Avaliar possível correlação do índice de atividade de doença em modelo de colite ulcerativa induzida por dextran sulfato de sódio com o grau de severidade de danos na mucosa colônica e aumento de atividade de metaloproteinases. Métodos Colite foi induzida por administração oral de dextran sulfato de sódio 5% durante sete dias no grupo (n = 10), enquanto que o grupo controle (n = 16) recebeu água. Efeitos foram analisados diariamente pelo índice de atividade de doença. No sétimo dia, os animais foram sacrificados e as medições hematológicas, alterações histológicas (hematoxilina e eosina e coloração de azul Alcian), mieloperoxidase e atividades de metaloproteinases (MMP-2 e MMP-9) foram determinados. Resultados Grupo dextran sulfato de sódio mostrou elevação no índice de atividade de doença e redução dos parâmetros hematológicos. A indução da colite causa lesão no tecido, com perda de mucina e aumento da mieloperoxidase (P<0,001) e as atividades MMP-9 (45 vezes) em comparação com o grupo de controle. Conclusões Neste estudo, observamos uma correlação do índice de atividade de doença com o grau de alterações histopatológicas após indução da colite por dextran sulfato de sódio, podendo associar este resultado ao aumento principalmente da atividade de MMP-9 e de mieloperoxidase. .

Purificação e utilização das condroitinases B e AC de Flavobacterium heparinum no estudo dos proteoglicanos de matriz extracelular / Purification and utilization of chondroitinases AC, B and C from Flavobacterium in the study of proteoglycans the extracellular matrix

As condroitinases AC, B e C de Flavobacferium heparinum são importantes instrumentos para a identificação e a análise da estrutura de condroitim sulfatos e dermatam sulfatos, bem como de seus proteoglicanos, de diferentes origens. Entretanto, para que sejam úteis, preparações de enzimas puras e estáveis devem ser obtidas. No presente trabalho, descrevemos um procedimento simples, reprodutível e com alto rendimento para preparo dessas enzimas, baseado em cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF e cromatografia de interação hidrofóbica em Pheny-Sepharose HP. Para análise quantitativa da purificação e do rendimento das enzimas purificadas, estabelecemos uma metodologia que se baseia na queda em metacromasia que acompanha a despolimerização dos glicosaminoglicanos. Este método, que utiliza a interação dos glicosaminoglicanos com azul de dimetilmetileno, permitiu a dosagem das condroitìnases presentes em extratos brutos induzidos de F. heparinum e nas preparações purificadas. A vantagem deste procedimento sobre outros métodos comumente empregados, que quantificam os produtos insaturados formados, é que a. presença de glicuronidases e sulfatares não interfere na determinação das atividades enzimáticas. As condroitinases AC e B assim preparadas foram empregadas na identificação e na análise estrutural de proteoglicanos e glicosaminoglicanos extraídos de diversos tecidos e fluidos biológicos, como córnea humana, urina, soro e diversos tecidos de gato, miométrio e leiomioma humanos. Além disso, uma nova metodologia foi desenvolvida para imunolocalizar proteoglicanos de condroitim sulfato ou dermatam sulfato em cortes de tecidos. Essa metodologia baseia-se na incubação de cortes de tecidos com condroitinase AC (para condroitim sulfato) ou condroitinase 8 (para dermatam sulfato). Em seguida, os resíduos insaturados gerados pelas enzimas são reconhecidos por anticorpos monoclonais específicos. Estudos de dupla marcação para as cadeias de condroitim sulfato ou dermatam sulfato e o esqueleto protéico (decorim ou versicam) ou queratam sulfato ou, ainda, filamentos de actina foram também realizados. As imagens de dupla marcação foram submetidas a análise morfométrica, utilizando a ferramenta MATLAB, para determinação do grau de co-localização...