In vitro culture of ovine mammary gland cells expressing beta-lactoglobulin and beta-casein / Células da glândula mamária ovina cultivadas in vitro expressam beta-lactoglobulina e beta-caseina

The expression of milk proteins in vitro is essential to exploit the mammary gland cells as a biological model. Enzymatic tissue disaggregation has been widely used to establish mammary cell culture, but its effect in long-term ovine mammary cell culture is not completely elucidated. This study aimed at comparing mechanical/enzymatic and mechanical dissociation methods to establish ovine mammary cell culture. We compared cellular differentiation induced by lactating ewe serum or fetal bovine serum based on the gene expression levels of milk proteins (beta-lactoglobulin, alpha s1-casein, and betacasein). Mechanically dissociated cells were positive immunostaining for cytokeratin 8.13, such as mammary epithelial cells. These cells are responsible for milk protein expression and they are low immunostaining for vimentin, mesenchymal marker. Mechanical/enzymatic dissociation cells were positive for vimentin. The fastest cell growth (cell/hour) was observed in the mechanical dissociation group cultured with 10% fetal bovine serum medium. Mechanically and mechanically/enzymatically derived cells were able to express beta-casein and beta-lactoglobulin, but not alpha s1-casein. The relative expression of beta-lactoglobulin was not affected by the tissue dissociation method or culture media, beta-casein relative expression was down regulated in mechanically dissociated cells cultured in the presence of lactating ewe serum, (P = 0.019). Beta-casein relative expression was also down regulated in mechanically/enzymatically dissociated cells cultured with fetal bovine serum (P = 0.021). In the present conditions, we conclude that mechanical dissociation followed by culture with 10% of fetal bovine serum was the most efficient method to induce milk proteins' mRNA expression by ovine mammary epithelial cells in vitro.(AU)

A expressão in vitro de proteínas do leite é essencial para explorar as células da glândula mamária como um modelo biológico. A desagregação tecidual via enzimática é amplamente utilizada para o estabelecimento cultivo de células mamárias. No entanto, seu efeito a longo prazo no cultivo de células da glândula mamária ovina ainda não é bem elucidado. Este estudo tem como objetivo comparar dois métodos de dissociação tecidual, mecânico/enzimático e mecânico, para estabelecer cultivo celular de glândula mamária ovina. A indução da diferenciação celular, por adição de soro de ovelha lactante ou soro fetal bovino, foi avaliada pelos níveis de expressão de proteínas do leite (beta-lactoglobulina, alpha s1-caseína e beta-caseína). Células mecanicamente dissociadas foram positivamente marcadas para a presença de citoqueratina 8.13, marcador para células epiteliais mamárias. Essas células são as responsáveis pela produção das proteínas do leite e são pouco marcadas para a presença de vimentina, marcador para células de origem mesenquimal. Já as células obtidas da dissociação mecânica/ enzimática foram positivamente marcadas para presença de vimentina. A maior velocidade de crescimento (células/hora) foi observado para o grupo com dissociação mecânica cultivado em meio com 10% de soro fetal bovino. As células obtidas tanto da dissociação mecânica quanto mecânica/enzimática foram capazes de expressar beta-lactoglobulina e beta-caseína, mas não alfa s1-caseína. A expressão relativa de beta-lactoglobulina não foi afetada pelo método de dissociação ou meio de cultivo. A expressão relativa da beta-caseína foi negativamente regulada para células mecanicamente dissociadas e cultivadas na presença de soro de ovelha lactante (P = 0,019). A expressão relativa da beta-caseína também foi negativamente regulada para células dissociadas de forma mecânica/enzimática e cultivadas com soro fetal bovino (P = 0,021). Nas condições do presente estudo, concluímos que o método de dissociação mecânica seguido pelo cultivo em meio com 10% de soro fetal bovino foi o método mais eficiente para induzir a expressão mRNA de proteínas do leite por células epiteliais mamárias ovinas in vitro.(AU)

Comparison of different methods for exogenous DNA uptake by bovine spermatozoa / Comparação de diferentes métodos de incorporação de DNA exógeno pelo espermatozoide bovino

Although genetic manipulation of farm animals is of great interest for animal production and the pharmaceutical industry, its efficiency remains far from satisfactory. Pronuclear injection, which is the most widely used technique for such modification, mainly in mice, remains limited for this species. Some alternatives have been developed such as sperm mediated gene transfer, in which the spermatozoa are used as vectors for DNA delivery during in vitro fertilization. Mature sperm cells are able to spontaneously bind exogenous DNA molecules which may be internalized into sperm nuclei. Given the potential of sperm mediated gene transfer for livestock animals transgenesis, the aim of this study was to evaluate four methods of DNA uptake for sperm mediated gene transfer in bovine: incubation with DNA, plasma membrane alteration induced by calcium ionophore followed by incubation with DNA, electroporation and lipofection. Spermatozoa not exposed to exogenous DNA were used as control group. Cleavage, blastocyst and hatching rates were recorded at 72 hours post insemination (hpi), days 9 and 12 of embryo culture, respectively. Exogenous DNA-positive embryos were evaluated by PCR. No effect of treatment was observed on cleavage, blastocyst and hatching rates. In addition, percentage of DNA positive blastocysts did not differ among experimental groups. In spite of the low number of positive embryos, our results show that all treatments presented similar efficiencies for DNA delivery during in vitro fertilization. In conclusion, although the development rates were similar and constant in all groups, other factors such as exogenous DNA sequence, size and concentration should be considered to improve sperm mediated gene transfer.

Apesar da manipulação genética de animais domésticos ser de grande interesse para a produção animal e para a indústria farmacêutica, a sua eficiência ainda é insatisfatória. A injeção pronuclear, a técnica mais utilizada para tal propósito, principalmente em camundongos, ainda apresenta limitações para esta espécie. Algumas alternativas têm sido desenvolvidas como o uso de espermatozoides como vetores para transferência gênica, na qual a célula espermática tem habilidade espontânea de se ligar à molécula de DNA e internalizá-la. Dado o potencial da transferência gênica mediada por espermatozoide para animais domésticos transgênicos, o objetivo do presente trabalho foi a avaliação de quatro métodos de incorporação de DNA para a transferência gênica mediada por espermatozoides na espécie bovina: incubação com DNA, alteração da membrana plasmática induzida por cálcio ionóforo seguida por incubação com o DNA exógeno, eletroporação e lipofecção. Espermatozoides não expostos ao DNA exógeno foram usados como grupo controle. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliados, respectivamente, as 72 horas após a inseminação dos oócitos, bem como, aos 9 e 12 dias de cultivo embrionário. Os embriões positivos para o DNA exógeno foram avaliados por PCR. Nenhum efeito de tratamento foi observado nos índices de clivagem, blastocisto e eclosão. Além disso, a porcentagem de blastocistos positivos para o DNA exógeno não diferiu entre os grupos experimentais. Apesar do baixo número de embriões positivos para DNA exógeno, os resultados obtidos mostram que todos os tratamentos apresentaram eficiências similares. A conclusão obtida foi que, apesar de os índices de desenvolvimento embrionário terem sido similares e constante em todos os grupos experimentais, outros fatores como a sequência, o tamanho e a concentração do DNA exógeno devem ser avaliados para melhorar a transferência gênica mediada por espermatozoides.

Reproductive performance of sows inseminated with diluted semen treated with homeopathic medicine

Aims: this study sought to assess the reproductive performance of sows inseminated with sperm treated with homeopathic medicines. Materials and methods: the semen of 2 sexually mature boars age 18 months Pietrain and Duroc cross-bred with similar genetic and reproductive performance were chosen, as well as 125 sows. Sixteen samples of semen were collected and standardized through semen evaluation. Three homeopathic preparations and a placebo (control) were tested on the sperm (n=31/32 per group): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. Sows were inseminated 3 times with the same estrous diagnostic procedures. Results: there was significant difference (p<0.05) between Avena sativa 6cH and the other 3 groups regarding the return to estrus and parturition rate. There was no significant difference among the groups regarding the number of newborn piglets. Conclusion: these data suggest that homeopathic preparation Avena sativa may be used directly on sperm cells to improve the parturition rate in technified swine farms.

Objetivos: este estudo buscou avaliar o rendimento reprodutivo de suínos inseminados com esperma tratado com medicamentos homeopáticos. Materiais e métodos: o esperma de dois suínos sexualmente maduros de 18 meses de idade híbridos Pietrain e Duroc, com rendimento genético e reprodutivo similares foi selecionado, assim como 125 fêmeas. Dezesseis amostras de esperma foram coletadas e estandarizadas através de avaliação do esperma. Três preparações homeopáticas e um controle (placebo) foram testados no esperma (n=31/32 por grupo): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. As fêmeas foram inseminadas 3 vezes com os mesmos procedimentos de diagnóstico do estro. Resultados: houve diferença significativa (p< 0,05) entre Avena sativa 6cH e os outros 3 grupos no retorno ao estro e taxa de partos. Não houve diferença significativa entre os grupos no número de recém-nascidos. Conclusão: os dados sugerem que a preparação homeopática Avena sativa pode ser utilizada diretamente nas células espermáticas para melhorar a taxa de partos em fazendas tecnificadas de criação de suínos.

Objetivos; este estudio busco evaluar el rendimiento reproductivo de porcinos inseminados com esperma tratado com medicamentos homeopáticos. Materiales y métodos: el esperma de 2 porcinos sexualmente maduros de 18 meses de edad híbridos Pietrain y Duroc, com rendimiento genético y reproductivo similares fue seleccionado, así como 125 hembras. Dieciséis muestras de esperma fueron recogidas y estandarizadas mediante evaluación del esperma. Tres preparados homeopáticos y un control (placebo) fueron testeados en el esperma (n=31/32 por grupo): Avena sativa 6cH, Pulsatilla nigricans 6cH and Avena sativa 6cH + Pulsatilla nigricans 6cH. Las hembras fueron inseminadas 3 veces con los mismos procedimientos de diagnóstico del estro. Resultados: hubo diferencia significativa (p< 0,05) para Avena sativa 6cH en comparación con los demás grupos en el retorno al estro y tasa de partos. No hubo diferencia significativa entre ninguno de los grupos en el número de recién nacidos. Conclusión: estos datos sugieren que el preparado homeopático Avena sativa puede ser directamente utilizado en las células espermáticas para mejorar la tasa de partos en granjas tecnificadas de porcinos.Palabras llave: porcinos; rendimiento reproductivo; esperma; homeopatía; estudio ciego controlado.