ABSTRACT
RESUMEN Las actinobacterias incluyen miembros productores de compuestos multipropósitos restringidamente sobreexplotados al género Streptomyces. No obstante, es necesario reorientar la exploración de bacterias no estreptomiceas para el uso de nuevos bioagentes ecológicos con miras a evitar redescubrimientos y contrarrestar la resistencia a insecticidas químicos en Aedes aegypti. En esta investigación, se caracterizó actinobacterias formadoras de biopelículas para evaluar su dinámica de crecimiento, actividad larvicida y efectos subletales. La identificación, crecimiento y bioactividades de los patógenos se realizaron por cultivos, análisis de imágenes por fotomicrografía y bioensayos. Las biopelículas pertenecen a Pseudonocardiaceae (PsA1TA) y Corynebacteriaceae (CoA2CA) característicamente dependientes a crecer sobre sustratos con revestimiento cuticular específico. PsA1TA coloniza estructuras membranosas de tórax y abdomen de larvas. Las microcolonias desarrollan infectivamente a biopelículas mono y biestratificadas hasta cubrir cuatro veces la amplitud toracoabdominal (envergadura infectiva entre 1010 μm a 1036 μm). En contraste, CoA2CA envuelve radialmente estructuras esclerotizadas cefálica y anal al triplicar la amplitud de los órganos infectados (envergadura infectiva: 1820 a 2030 μm y 1650 a 1860 μm, respectivamente). Las biopelículas ejercen mortalidad diferenciada a todas las etapas larvarias, no obstante, PsA1TA resultó más mortal y virulento frente al segundo estadio (58 %-96 horas, TL50: 3,4 días), mientras que CoA2CA lo fue sobre el cuarto estadio larval (85 %-96 horas, TL50: 2,5 días). CoA2CA indujo emergencia incompleta de farados y despliegue de tarsos curvos en adultos emergentes, además de revestir cadáveres larvarios con robustas biopelículas. Los morfotipos actinobacterianos revelan efecto larvicida y subletal en A. aegypti por formación de biopelículas.
ABSTRACT Actinobacteria include several ubiquitous members involved in the synthesis of multipurpose bioactive compounds strictly derived from the genus Streptomyces. Nevertheless, new bacterial consortia based on non-streptomycetes actinobacteria are needed to be explored in order to avoid rediscoveries and minimize the development of insecticide resistance in Aedes aegypti. In accordance with the use of eco-friendly bioagents, in this study biofilm-forming actinobacteria were characterized on the basis of assessment their growth dynamics, larvicidal mortality and sublethal effects. Actinobacteria identification, biofilm growth and larvicidal bioactivities were performed by employing bacterial cultures, photomicrograph-based image analysis and bioassays. Bacterial morphotypes belong to Pseudonocardiaceae (PsA1TA) and Corynebacteriaceae (CoA2CA), which showed a distinctly substrate-dependent growth. PsA1TA microcolonies were randomly distributed on abdominal and thoracic membranous epicuticle. Afterwards, the thickness of mono-and bi-layered biofilms were increased fourfold the larval thoracoabdominal width (infectious breadth, 1010 μm - 1036 μm). In contrast, cephalic and anal sclerotized structures were radially encased by CoA2CA biofilms and increased threefold the size of both structures (infectious breadth, 1820 - 2030 μm y 1650 - 1860 μm, respectively). Although biofilms caused dissimilar mortality rates on the four larval instars, PsA1TA exerted highest larvicidal activity and virulence on second instar larvae (58 %-96 hours, LT50: 3.4 days) y CoA2CA on fourth instar larvae (85 %-96 hours, LT5G: 2.5 days). CoA2CA also induced incomplete release of pharate individuals as well as buckled protruding tarsi in newly emergent adults, whilst larval cadavers were overwhelmingly encased within massive biofilm aggregates. Biofilm-forming actinobacteria performed biolarvicidal activity and sublethal responses in A. aegypti.
ABSTRACT
Resumen El objetivo de este estudio fue demostrar que los principios activos de las semillas de Annona muricata combinados con el extracto etanólico y dimetilsulfóxido (EE-DMSO), incrementan la mortalidad de larvas IV y pupas de Aedes aegypti con relación a extractos acuosos (EA) y extractos etanólicos (EE). Las bioactividades se calcularon por comparación de los porcentajes de mortalidad a las 6, 12, 24 y 48 horas in vitro y campo simulado. Los resultados indicaron mortalidad progresiva dependiente de las concentraciones y tiempos de exposición en larvas y reacción knock-down en pupas. In vitro a 5 mg.L-1, EA y EE ejercieron 100% de mortalidad larvaria en 24 horas de exposición (CL50=46.16 y 19.28 mg.L-1 respectivamente), en contraste con EE-DMSO, que inició sobre 62% con 0.5 mg.L-1 a las 6 horas (CL50=20.33 mg.L-1). La acción pupicida de EA y EE reveló 100% de mortalidad desde 24 horas en todas las concentraciones, a diferencia de EE-DMSO que se alcanzó entre 6 y 12 horas. En campo simulado, EA y EE ejercieron 100% de mortalidad a las 24 horas en larvas (16.91 y 21.21 mg.L-1 ), mientras que en pupas (20.44 y 23.03 mg.L-1) ocurrió a las 12 horas, entretanto, la actividad pupicida de EE-DMSO fue 100% en 6 horas. Los efectos comparativos in vitro y campo simulado denotaron patrones similares de respuestas larvicida y pupicida, pero con mayor sensibilidad en pupas. Los principios activos de las semillas de A. muricata combinados con EE-DMSO potencian la respuesta mortal de larvas y pupas de A. aegypti in vitro y campo simulado.
Abstract The objective of this study was to demonstrate that active ingredients of Annona muricata seeds can be enhanced as a result of mixture of both ethanolic extract of A. muricata seeds and Dimethylsulfoxide (EE-DMSO). Percentage mortalities at 6, 12, 24 and 48 hours on fourth instar larvae and pupae of Aedes aegypti were calculated in order to compare bioactivities of aqueous (AE), ethanolic extracts (EE) and EE-DMSO under laboratory and simulated field conditions. Results showed larval mortality concentration- and time-dependent, and knock-down responses in pupae. In laboratory, AE and EE exerted 100% larval mortality at 5 mg.L-1 after 24 hours (LC50= 46.16 and 19.28 mg.L-1). Conversely, EE-DMSO showed between 62 - 100% mortality at 0.5 mg.L-1 for over 6 hours (LC50= 20.33 mg.L-1). Pupicidal effects in AE and EE revealed 100% mortality at 24 hours employing all concentrations, except in EE-DMSO which commenced when individuals were exposed between 6 and 12 hours. In simulated field, AE and EE provoked 100% larval mortality at 24 hours (16.91 y 21.21 mg.L-1) while pupal mortality at 12 hours (20.44 y 23.03 mg.L-1). Percentage mortality of pupae was 100% using EE-DMSO even before 6 hours. Comparative toxic effects of laboratory and simulated-field systems have shown to maintain a similar pattern of larval mortality and more sensitive responses in pupae. Accordingly, larval and pupal mortality responses of A. aegypti were enhanced with the use of EE-DMSO and active ingredients of A. muricata seeds under laboratory and simulated field conditions.