Investigação da dinâmica mutacional em tumores triplo-negativos da mama através do sequenciamento de DNA tumoral circulante / Investigation of mutational dynamics in triple-negative breast cancer through circulating tumor DNA sequencing

O câncer de mama de imunofenótipo triplo-negativo (TN) é considerado um subtipo agressivo correspondendo a 10-20% dos casos. É caracterizado pela ausência dos receptores hormonais de estrogênio (ER) e de progesterona (PR) além de não apresentar super-expressão/amplificação do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Sendo assim, as terapias hormonais e moleculares efetivas em outros subtipos de câncer de mama, não têm efeito nesses tumores. A quimioterapia sistêmica neoadjuvante é o tratamento mais utilizado nesse subtipo de tumor de mama, sendo que para as pacientes que obtêm resposta patológica completa (RPC) observa-se um excelente prognóstico, entretanto no subgrupo com neoplasia residual observa-se prognóstico ruim. Isso ilustra a heterogeneidade clínica do tumor TN, com um subgrupo de tumores significativamente sensíveis à quimioterapia e outro resistente. Perda de função no gene BRCA1 tem sido frequentemente reportada em tumores TN de mama, seja por mecanismos genéticos ou epigenéticos. Há evidências de que tumores com deficiência de BRCA1 apresentam boas respostas a determinadas modalidades terapêuticas, como por exemplo, sais de platina e inibidores de PARP. Assim, a investigação mais detalhada no mecanismo de resposta ao tratamento, em mulheres acometidas com tumores TN, no contexto de deficiência de BRCA1, é de grande importância. A detecção de DNA tumoral circulante (ctDNA) tem surgido como uma estratégia pouco invasiva capaz de refletir as mutações presentes nas neoplasias, permitindo um acompanhamento do comportamento tumoral ao longo do tempo com promissor valor preditivo e prognóstico. Dessa forma, esse projeto objetivou investigar a dinâmica mutacional durante o tratamento quimioterápico, antes e após a cirurgia, através da análise de DNA tumoral circulante (ctDNA) como biópsia líquida em plasma de pacientes com tumores TN classificados em hereditários e esporádicos. Investigamos de forma ampla as características genéticas dos tumores TN e das pacientes em associação com as características clínicas e de resposta a tratamento. Quarenta e três pacientes com tumores TN foram recrutadas para o estudo e submetidas a teste genético para avaliar mutações germinativas patogênicas em genes de predisposição a câncer de mama. Com isso, classificamos 21% dos tumores em hereditários e 79% em esporádicos, onde 7 (16,3%) foram de pacientes portadoras de mutações germinativas em BRCA1, uma (2,3%) em BRCA2, uma (2,3%) em TP53. Além disso, 25 foram portadoras de variantes de significado incerto (58,1%) e 9 (20,9%) casos foram negativos. Desse total, 34 pacientes já foram avaliadas quanto à resposta ao tratamento neoadjuvante, sendo que 18 (53%) pacientes apresentaram doença residual e 16 (47%) evoluíram com RPC. A investigação do tecido tumoral foi possível para 23 casos. Desses, 3 tumores (13%) foram classificados com alta carga mutacional. Ainda, para 18 tumores foi possível identificar variantes somáticas nos painéis utilizados com uma média de 2 variantes/tumor. O gene mais frequentemente mutado foi o TP53 (65%) seguido de SYNE1 (16,7%) e outros menos frequentes. Não houve associação entre genes preferencialmente mutados e a classificação dos tumores em hereditários ou esporádicos. Para 17 das 18 pacientes com mutações somáticas detectadas no tumor foi realizada a investigação no DNA circulante no plasma antes do início do tratamento (baseline). Um total de 10 pacientes (58,8%) foi positivo para ctDNA. Observou-se uma tendência de maiores níveis de ctDNA nos casos que evoluíram com doença residual em relação aos que obtiveram resposta patológica completa, sugerindo uma associação entre a quantidade de DNA tumoral e ctDNA. Durante o monitoramento, foi observada que para 7 (41%) casos houve persistência de ctDNA, a qual antecipou achados clínicos como, progressão local e metástase. Nesse trabalho, reforça-se a associação entre inativação de BRCA1 e os tumores TN e é demonstrado o potencial do monitoramento de ctDNA em amostras de plasma para antecipar progressão da doença mostrando uma ferramenta de grande potencial para monitoramento de pacientes submetidos à quimioterapia

Triple-negative breast cancer (TNBC) is considered an aggressive breast cancer subtype corresponding to 10-20% of cases. It is characterized by the absence of estrogen (ER) and progesterone (PR) hormonal receptors and lack of overexpression/amplification of the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Thus, hormonal and molecular therapies effective in other breast cancer subtypes have no effect on these tumors. Neoadjuvant systemic chemotherapy is the most widely used treatment for TNBC, and patients with pathological complete response (pCR) have an excellent prognosis, whereas in the subgroup with residual disease, a poor prognosis is observed. This illustrates the clinical heterogeneity of TNBC, with one subset of tumors being sensitive to chemotherapy and one resistant. Loss of function in the BRCA1 gene has often been reported in TNBC, either by genetic or epigenetic mechanisms. There is evidence that BRCA1-deficient tumors have good responses to certain therapeutic modalities, such as platinum salts and PARP inhibitors. Thus, a more detailed investigation of the mechanism of response to treatment in women with TNBC in the context of BRCA1 deficiency is of great importance. The detection of circulating tumor DNA (ctDNA) has emerged as a noninvasive strategy capable of reflecting the mutations present in the neoplasms, allowing the monitoring of tumor behavior over time with promising predictive and prognostic value. Thus, this project aimed to investigate the mutational dynamics during chemotherapy treatment, before and after surgery, through the analysis of ctDNA as a liquid biopsy in plasma of patients with hereditary and sporadic TNBC. We have broadly investigated the genetic characteristics of TNBC and patients in association with clinical and treatment response characteristics. Forty-three patients with TNBC were recruited to the study and underwent genetic testing to evaluate pathogenic germline mutations in breast cancer predisposing genes. We classified 21% of tumors as hereditary and 79% as sporadic, where 7 (16.3%) were from patients with germline mutations in BRCA1, one (2.3%) in BRCA2 and one (2.3%) in TP53. In addition, 25 (58.1%) had variants of uncertain significance and 9 (20.9%) cases were negative. Of this total, 34 patients have already been evaluated for response to neoadjuvant treatment, and 18 (53%) patients had residual disease and 16 (47%) evolved with pCR. Investigation of tumor tissue was possible for 23 cases. Of these, 3 tumors (13%) were classified with high mutational load. Furthermore, for 18 tumors it was possible to identify somatic variants in the panels used with an average of 2 variants per tumor. The most frequently mutated gene was TP53 (65%) followed by SYNE1 (16.7%) and other less frequent genes. There was no association between preferentially mutated genes and tumor classification in hereditary or sporadic. For 17 of the 18 patients with somatic mutations detected in the tumor, circulating plasma DNA was investigated before treatment (baseline). A total of 10 patients (58.8%) were positive for ctDNA. There was a trend for higher levels of ctDNA in cases that evolved with residual disease than in those with pCR, suggesting an association between the amount of tumor DNA and ctDNA. During the monitoring, it was observed that 7 (41%) cases were persistent for ctDNA, which anticipated clinical findings such as local progression and metastasis. In this study, the association between BRCA1 inactivation and TNBC is reinforced and it is demonstrated the potential of monitoring ctDNA in plasma samples for the anticipation in the identification of disease progression, providing a tool of great potential for monitoring residual disease in patients undergoing chemotherapy

Homeostatic unbalance via HSPA5 gene expression in HepG2C3A cells exposed to alpha-tomatine / Desequilíbrio homeostático através da expressão do gene HSPA5 em células HepG2C3A exposto a alpha-tomatine

The α-tomatine is a glycoalkaloid found in immature tomatoes (Lycopersicon esculetum). Currently, α-tomatine has shown anticancer effects due to its anti-proliferative property. Stressors are one of the factors contributing to the antiproliferative activity of α-tomatine that can modify cellular homeostasis.Among the cell stressors are the endoplasmic reticulum stress response elements, which can be alteredleading to cell death. In the course of this study, we verified the expression of genes involved in the stress response of the endoplasmic reticulum in HepG2/C3A cells. The α-tomatine reduced the viability of HepG2/C3A cells in a dose-dependent manner. Thus, we selected 2µg/mL of α-tomatine (62% incell viability) to evaluate the gene expressions. After 24 hours of exposure to α-tomatine, the level of HSPA5 transcripts was reduced. The HSPA5 chaperone reduced marker is an indicative of homeostasisunbalance with the consequent lack of cellular resistance and, probably, cell death. Our results indicate the involvement of oxidative stress mechanisms in the death of HepG2/C3A cells exposed to α-tomatine.

A α-tomatina é um glicoalcaloide encontrado no tomate imaturo (Lycopersicon esculetum). Atualmente,a α-tomatina tem mostrado efeito anticancerígeno devido sua propriedade antiproliferativa. O estresse celular é um dos fatores que contribui para a atividade antiproliferative da α-tomatina que pode modificara homeostase celular. Entre os estressores celulares esta os elementos de resposta ao estresse do retículo endoplasmático, que podem ser alterados, levando à morte celular. No decorrer deste estudo, verificamos que a expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse do retículo endoplasmático em célulasHepG2/C3A. A α-tomatina reduziu a viabilidade das células HepG2/C3A de forma dose-dependente.Assim, selecionamos a concentração de 2μg/mL de α-tomatina (viabilidade celular de 62%) para avaliara expressão gênica. Após 24 horas de exposição a α-tomatina, o nível de transcrição de HSPA5 foireduzido. A redução de HSPA5 é um indicativo de desequilíbrio da homeostase, com a consequente falta de resistência celular e, provavelmente, a morte celular. Nossos resultados indicam o envolvimento de mecanismos de estresse oxidativo na morte de células HepG2/C3A exposto a α-tomatina e mostram a eficácia do sistema como um futuro candidato para os estudos de terapia de câncer.

Avaliação da prevalência de mutação no gene BRCA1 emtumores triplo-negativos de mama: associação da mutação comcaracterísticas clínicas e de resposta terapêutica / Evaluation of BRCA1 gene mutation prevalence in triple negative breast cancer: Association of mutation with clinical features and treatment response

O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente em mulheres em todo o mundo, excluindo os casos de câncer de pele não-melanoma. A estimativa de incidência para o biênio de 2014-2015 no Brasil é de mais de 57 mil novos casos por ano. O câncer de mama é uma doença heterogênea, podendo ser dividida em subtipos de acordo com o perfil imunofenotípico e de expressão gênica desses tumores. Em relação ao perfil imunofenotípico, o tumor de mama triplo-negativo (TN) é caracterizado pela ausência dos receptores hormonais de estrogênio (ER) e de progesterona (PR) além de não apresentar super-expressão/amplificação do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Essa condição é importante, pois as terapias hormonais e moleculares efetivas em outros subtipos, não têm efeito nesses tumores, sendo o tratamento feito com base em quimioterapia sistêmica. Somado a isso, o tumor TN demonstra maior agressividade e padrões metastáticos distintos dos outros tumores, o que resulta em pior prognóstico e sobrevida para as pacientes portadoras desses tumores. Vários trabalhos, incluindo do nosso grupo de pesquisa, têm relatado alta prevalência de mutações germinativas patogênicas no gene BRCA1 em mulheres jovens portadoras de tumores TN de mama...

Breast cancer is the most frequent type of cancer in women worldwide, with exception of non-melanoma skin cancer. The incidence estimate for 2014-2015 biennium in Brazil is more than 57 thousand new cases per year.Breast cancer is a heterogeneous disease that is divided according to immunophenotypic and gene expression profiles of the tumors. Regarding the immunophenotypic profile, the triple-negative breast cancer (TNBC) is characterized by the lack of hormonal receptors for estrogen and progesterone (ER and PR) and also the absence of superexpression/ amplification of the Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2). This condition is important because hormonal and molecular therapies have no effect on these tumors. Therefore systemic chemotherapy is the mainstay treatment. Moreover, TNBC displays higher aggressiveness and distinct metastatic pattern compared to other breast tumors, resulting in worse prognosis and survival for TNBC patients. Several researchers, including our research group, have reported high prevalence of germline pathogenic mutations in the BRCA1 gene among young women diagnosed with TNBC. This gene is involved primarily in the mechanism of DNA repair by homologous recombination and acts as a tumor suppressor gene. Thus, germline mutation that leads to loss of function of its respective protein may favor cancer development, mostly in the breast and ovarian of carriers. However, it is not well stablished the proportion of pathogenic...