Accurate identification of atypical Staphylococcus chromogenes plasma-clotting strains causing bovine mastitis / Identificação acurada de cepas atípicas de Staphylococcus chromogenes que coagulam o plasma envolvidas com mastite bovina

ABSTRACT: We compared the potential of routine techniques used for the identification of Staphylococcus species, aiming to evaluate their accuracy in the detection of 43 Staphylococcus chromogenes strains isolated from bovine mastitis that, despite being a coagulase-negative species, are able to clot plasma. These strains could be mistakenly suspected to be S. aureus and lead to an unappropriated treatment of the disease. MALDI-TOF, PCR-RFLP of the chaperonine gene groEL, and sequencing of the 16S rRNA and elongation factor Tu gene tuf were employed. Results from the four methods were coincident for only half of the strains because of the low accuracy of the groEL PCR-RFLP (51.2% accuracy). Even though all the sequencing results were identical, the high accuracy of the MALDI-TOF results (97.7% accuracy, with only one strain misidentified) encourage the use of this technique, since it does not require laborious sample preparation, being fast and simple to perform.

RESUMO: Nós comparamos o potencial de técnicas rotineiras utilizadas para a identificação de espécies de Staphylococcus, com o objetivo de avaliar a acurácia delas na detecção de 43 isolados de Staphylococcus chromogenes envolvidos com mastite bovina que, apesar de ser uma espécie coagulase-negativa, são capazes de coagular o plasma. Essas cepas poderiam ser erroneamente suspeitas de serem S. aureus e levarem a um tratamento não adequado da doença. MALDI-TOF, PCR-RFLP do gene da chaperonina groEL e sequenciamento do gene do rRNA 16S e do gene do fator de elongação Tu, tuf, foram avaliados. Os resultados dos quatro métodos foram coincidentes para apenas metade das cepas, devido à baixa precisão da PCR-RFLP com groEL (51,2% de acurácia). Apesar de todos os resultados do sequenciamento serem idênticos, a alta precisão dos resultados do MALDI-TOF (97,7% de acurácia, com apenas uma cepa identificada incorretamente) encoraja o uso dessa técnica, pois, não requer preparação laboriosa de amostras, sendo rápida e simples de executar.

Relationship between total bacteria counts and somatic cell counts from mammary quarters infected by mastitis pathogens / Relação entre contagem total de bactérias e contagem de células somáticas de quartos mamários infectados por patógenos da mastite

This study was conducted to establish the relationship between somatic cell count (SCC) and bacterial shedding from mammary quarters according to mastitis pathogens. Milk samples from 638 mammary quarters were examined for mastitis pathogens, SCC and total bacterial count (TBC). The raw data of SCC and TBC were used to perform descriptive statistics. The significance of the arithmetic mean differences between SCC and TBC according to bacteriological examination results was determined by a two-tailed unpaired t-test. Pearson and Spearman´s correlations were done with logarithmic data and linear regression analyses. The geometric means of the bacteriological examination results were (cells mL-1; CFU mL-1): no growth (52,000; 12,000), coagulase-negative staphylococci (85,000; 17,000), Staphylococcus aureus (587,000; 77,000); other streptococci (432,000; 108,000) and Streptococcus agalactiae (1,572,000; 333,000). The Pearson and Spearman's correlations between SCC and TBC were higher than 0.60 for all mastitis pathogens. The regression analyses slopes showed different increase in TBC with the same increase in SCC according to mastitis pathogens. The slope for S. agalactiae (0.542) was higher than that for other mastitis pathogens. The results suggest that the intensity of inflammatory process was associated with number of mastitis pathogens shedding from the mammary gland.

Este estudo foi realizado com objetivo de estabelecer a relação entre contagem de células somáticas (CCS) e a liberação de bactérias de quartos mamários de acordo com os patógenos da mastite. Amostras de leite de 638 quartos mamários foram examinadas para identificação dos patógenos da mastite, CCS e contagem total de bactérias (CTB). Estatísticas descritivas foram utilizadas para avaliar os dados brutos de CCS e CTB. A diferença entre médias para CCS e CTB de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foi avaliada pelo teste T para amostras independentes. Foram realizadas a correlação de Pearson, de Spearman e regressão linear com os dados transformados. As médias geométricas de acordo com os resultados dos exames bacteriológicos foram (células mL-1; UFC mL-1): sem crescimento (52.000; 12.000), estafilococos coagulase negativo (85.000; 17.000), Staphylococcus aureus (587.000; 77000); outros estreptococus (432.000; 108.000) e Streptococcus agalactiae (1.572.000; 333.000). A correlação de Pearson e Spearman entre CCS e CTB foi maior que 0,60 para todos os patógenos da mastite. O coeficiente angular das regressões lineares mostrou diferentes aumentos da CTB como o mesmo aumento da CCS de acordo com os patógenos da mastite. O coeficiente angular para o S. agalactiae (0.542) foi maior em relação aos outros patógenos da mastite. Os resultados sugerem que a intensidade do processo inflamatório foi associada com a quantidade de bactérias da mastite liberada pela glândula mamária.

Composition and bulk tank somatic cell counts of milk from dairy goat herds in Southeastern Brazil / Composição e contagem de células somáticas no leite de rebanhos caprinos do Sudeste do Brasil

The milk composition and somatic cell count (SCC) are requirements for assessment milk quality and mastitis in goat herds. Studies conducted with dairy goat herds indicated that the milk composition differed among them to due to factors such as genetic, feeding, system of production, stage of lactation, year and year-season. The objective of this study was to assess SCC and other milk quality indicators (fat, protein, lactose, and total solids) for goat milk bulk tank. The influence of the herd and year-season on the milk composition as well as herd, milking system and year-season on SCC was also evaluated. Thirteen Brazilian dairy goat herds with about 1,400 dairy goats were included in the study. Six herds were milked by hand and in the remaining seven machine milking was used. Herds were sampled at weekly intervals during two lactations. A total of 913 bulk milk samples were analysed using a automated equipment. The general average percent values for fat, protein, lactose and total solids were, respectively,3.44, 2.95, 4.45 and 11.69. The effect of herd and season was significant for all milk components and bulk milk goat somatic cell count (SCC).The SCC average of all 13 herds was 779,000 cells/ml. The average SCC values of herds milked by hand and by machine were 1,121,000and 848,000 cells/ml respectively. In both groups, the SCC was lowerin the winter and higher in the autumn. Herd characteristics were responsible for higher variability on components and SCC in

A composição do leite bem como a contagem de células somáticas (CCS) são requisitos para avaliar a qualidade do leite e mastite em rebanhos caprinos. Estudos conduzidos indicaram que a composição do leite varia entre os rebanhos devido a fatores genéticos, alimentação, sistema de produção, estágio de lactação, ano e estação do ano. O objetivo do estudo foi avaliar a CCS e outros indicadores de qualidade(gordura, proteína, lactose e sólidos totais) no leite de rebanhos caprinos. A influência do rebanho e estação do ano sobre a composição bem como a influência de rebanho, tipo de ordenha e estação do ano sobre a CCS também foi avaliado. Treze rebanhos caprinos localizados no Brasil, com aproximadamente 1.400 matrizes foram incluídos no estudo, Sendo ordenhados manualmente e os outros sete com equipamento de ordenha. As amostras de leite dos rebanhos foram coletadas semanalmente durante duas lactações. O total de 913 amostras foi analisado no equipamento automatizado. A média dos valores percentuais para gordura, proteína, lactose e sólidos totais foram, respectivamente; 3,44; 2,95; 4,45 e 11,69. O efeito de rebanho e estação do ano foi significante para todos os componentes do leite e CCS. A média para CCS de todos 13 rebanhos foi 779.000 células/ml. As médias para CCS dos rebanhos ordenhados manualmente e mecanicamente foram, respectivamente, 1.121.000 e 848.000 células/ml. Em ambos grupos, a CCS foi menor no inverno e maior no outono. As características de rebanho foram responsáveis pela maior variação dos componentes e CCS no leite de rebanhos caprinos

Contagem, isolamento e caracterização de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado / Counting, isolation and characterization of psychrotrophic bacteria from refrigerated raw milk

Com os objetivos de quantificar, isolar e caracterizar bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado, produzido na região da Zona da Mata de Minas Gerais e Sudeste do Rio de Janeiro, foram analisadas amostras de leite coletadas de 20 tanques coletivos e 23 tanques individuais. As contagens de bactérias psicrotróficas nas amostras de leite para os dois tipos de tanques de refrigeração variaram entre 10² e 10(7) Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ml-1, porém, um maior número de tanques coletivos apresentou contagens acima de 1 x 10(5) UFC ml-1. Foi verificada a predominância de bactérias psicrotróficas gram-negativas (81,2 por cento), que foram identificadas pelos sistemas API 20E e API 20NE nos gêneros: Aeromonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Burkholderia,Chryseomonas, Enterobacter, Ewingella, Klebsiella, Hafnia, Methylobacterium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Serratia, Sphingomonas e Yersinia. As bactérias gram-positivas (18,8 por cento) foram identificadas com API 50 CH, API Coryne e API Staph, nos gêneros: Bacillus, Brevibacterium, Cellum/Microbacterium, Kurthia e Staphylococcus. Os sistemas API utilizados não identificaram todos os isolados bacterianos. Pseudomonas foi o gênero mais isolado e P. fluorescens foi a espécie predominante. A maioria dos isolados bacterianos apresentou atividade proteolítica e/ou lipolítica a temperaturas de refrigeração de 4ºC, 7ºC e 10ºC, evidenciando seu alto potencial de deterioração do leite e dos produtos lácteos. Os resultados ressaltam que maior atenção deve ser dada aos procedimentos que impeçam a contaminação do leite por esses microrganismos.

This study aimed to quantify, isolate and characterize psychrotrophic bacteria from refrigerated raw milk produced at the 'Mata' Region of Minas Gerais State and Southeast of Rio de Janeiro State, Brazil. Raw milk samples, were collected at the farms, from 20 collective refrigerated tanks and 23 individual refrigerated tanks. The psychrotrophic bacteria counting ranged from 10² to 10(7) Colony Forming Units (CFU) ml-1 for both types of refrigerated tanks, but most of the collective tanks showed counts higher than 1 x 10(5) CFU ml-1. Predominance of psychrotrophic gram-negative bacteria (81.2 percent), that were identified by API 20E and API 20NE as belonging to genera: Aeromonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Burkholderia, Chryseomonas, Enterobacter, Ewingella, Klebsiella, Hafnia, Methylobacterium, Moraxella, Pantoea, Pseudomonas, Serratia, Sphingomonas e Yersinia were oserved. The gram-positive bacteria (18.8 percent), were identified by API 50 CH, API Coryne and API Staph, to genera: Bacillus, Brevibacterium, Cellum/Microbacterium, Kurthia e Staphylococcus. The API systems utilized could not identify all the bacterial isolates. Pseudomonas was the genus most isolated with P. fluorescens as the predominant species. Most of the isolates presented proteolytic and/or lipolytic activity at 4ºC, 7ºC and 10ºC showing high potential for milk and milk products spoilage. The results indicated that more attention must be taken to the procedures necessaries to reduce milk contamination with psychrotrophic bacteria.

Esquema simplificado para identificaçäo de estafilococos coagulase-positivos isolados de mastite bovina / Simplifieed scheme for identification of coagulase-positive staphylococci isolated from bovine mastitis

Os testes de produçäo de acetoína, determinaçäo da atividade da enzima ß-galactosidase e utilizaçäo anaeróbica do manitol em conjunto com a susceptibilidade à acriflavina foram avaliados para diferenciaçäo de amostras de Staphylococcus coagulase-positivas (SCP) isoladas de mastite bovina. As amostras foram classificadas no gênero Staphylococcus por meio da sensibilidade a furazolidona, resistência à bacitracina, produçäo de ácido em aerobiose a partir de glicerol na presença de 0,4µg ml(-1) de eritromicina e catalase, e foram positivas no teste de coagulase do plasma de coelho em tubos. A susceptibilidade à acriflavina foi testada em placas de ágar P com 7,0µg ml(-1) de acriflavina. Como controle dos testes, foram incluídas cinco amostras coagulase-negativas de S. hyicus isoladas de leite bovino e identificadas pelo sistema API Staph e a amostra de S. aureus ATCC 29213. Trinta e oito das 49 amostras de SCP foram identificadas como S. aureus e 11 como S. hyicus, näo sendo identificada nenhuma como S. intermedius. O sistema API Staph foi empregado para confirmar a identificaçäo das amostras coagulase-positivas de S. hyicus, sete amostras de S. aureus negativas no teste de produçäo de acetoína e quatro negativas na fermentaçäo anaeróbica do manitol. Todas as amostras de S. aureus foram resistentes a acriflavina, enquanto as de S. hyicus foram sensíveis. Concluiu-se que a sensibilidade a acriflavina pode ser empregada juntamente com os testes de coagulase e produçäo de acetoína na diferenciaçäo de SCP isolados de mastite bovina.

Contagem bacteriana da superfície de tetas de vacas submetidas a diferentes processos de higienizaçäo, incluindo a ordenha manual com participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite / Bacterial counts on the surface of the teats of cows milked and different methods of udder preparation, including cows milked by hand and stimulated by suckling a calf

A pele da teta é uma das principais fontes de contaminaçäo microbiana do leite cru, além de ser uma fonte de infecçäo da glândula mamária. Este estudo comparou diferentes métodos de preparaçäo do úbere, incluindo a participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite, em relaçäo à contaminaçäo microbiana da pele da teta. Um experimento com 36 vacas ordenhadas mecanicamente foi conduzido para comparar três procedimentos (A, B, C) de preparaçäo do úbere. Duas tetas de cada vaca foram amostradas para contagem total de bactérias (CTB) e de coliformes, antes e após lavagem com água e secagem com papel toalha descartável (A); procedimento A, mais imersäo das tetas em soluçäo de iodo (4.000ppm) e secagem com papel toalha descartável (B); higienizaçäo com toalha de papel embebida em soluçäo desinfetante contendo clorexidina (C). O segundo experimento incluiu 16 vacas ordenhadas manualmente, na presença do bezerro. Permitiu-se a cada bezerro mamar as quatro tetas por alguns segundos, de acordo com o manejo do rebanho. Amostras para bacteriologia de duas tetas de cada vaca foram coletadas, antes, após a mamada do bezerro, e após higienizaçäo semelhante ao procedimento C, citado acima. Os tratamentos foram analisados usando-se o teste näo-paramétrico de Kruskal-Wallis, considerando-se os dados de tCTB após o uso de um dos métodos de preparaçäo do úbere ou da mamada do bezerro. Usou-se a transformaçäo das contagens bacterianas para a escala logarítmica em base 10, com a fórmula tCTB=log10 (CTB+0,5). Para os grupos A,B e C (primeiro experimento), Os valores médios de diminuiçäo de tCTB foram 1,8, 2,2 e 2,4, respectivamente. No segundo experimento, as CTB's aumentaram significativamente (p<0,05) de 3,2 para 4,3 após a mamada do bezerro, mas houve uma reduçäo (P<0,01) de mais de dez vezes após a aplicaçäo do desinfetante (2,0). Os resultados indicaram que: (a) lavagem das tetas com água seguida de secagem com papel toalha reduz o número de microrganismos da superfície das tetas, mas a reduçäo é muito maior quando se emprega um desinfetante; (b) a mamada do bezerro antes da ordenha aumenta em mais de dez vezes o número de bactérias na superfície das tetas; (c) o número de bactérias na pele das tetas pode ser reduzido em mais de 90 por cento após a mamada do bezerro, se as tetas forem cuidadosamente desinfetadas. Nas condiçöes dos experimentos realizados, a presença de coliformes foi insignificante.

Mastite bovina causada por Prototheca zopfii: relato de um caso / Clinical bovine mastitis caused by Prototheca zopfii: a case study

Um caso de mastite clínica causada por Prototheca zopfii em uma vaca de um rebanho leiteiro localizado na zona da Mata do Estado de Minas Gerais foi estudado. O animal apresentou sinais clínicos nos quartos mamários anteriores e queda acentuada na produçäo de leite. Após o diagnóstico inicial, o animal foi observado durante onze meses, do início da manifestaçäo da doença até 12 dias após o parto. Exames microbiológicos do leite foram realizados aos 7, 30, 39, 49, 65, 326 e 331 dias após o isolamento inicial, sendo os dois últimos exames realizados 7 e 12 dias após o parto. As amostras de P. zopfii isoladas apresentaram resistência in vitro a: ampicilina, canamicina, cefaloridina, enrofloxacina, estreptomicina, gentamicina, neomicina, oxacilina, penicilina, sulfonamidas e trimetoprim x sulfametoxazol. Foi avaliada a susceptibilidade in vitro das amostras de P. zopfii a um produto natural constituído de extrato de sementes de frutas cítricas, obtido comercialmente. A menor concentraçäo que inibiu totalmente a alga foi 1:500. Recomendou-se um tratamento com a diluiçäo a 1:200 do extrato em soluçäo fisiológica estéril contendo timerosal a 1:30.000 como conservante, em doses diárias de 20ml, por via intramamária. O tratamento foi realizado inicialmente durante sete dias. Após este período houve reduçäo, mas näo a completa eliminaçäo dos organismos do leite. Foi, entäo, recomendado mais um período de 15 dias de tratamento, de modo semelhante ao primeiro. Trinta e nove dias após o diagnóstico inicial näo foi mais isolado P. zofii do leite dos quartos afetados e a produçäo retornou a níveis semelhantes de antes da infecçäo. Amostras de leite naturalmente infectadas foram congeladas a 20§C. Células viáveis de P. zofii foram recuperadas de amostras mantidas até 38 dias nestas condiçöes.

Sensibilidade e especificidade do "California Mastitis Test" como recurso diagnóstico da mastite subclínica em relação à contagem de células somáticas / Sensitivity and specificity of the California Mastitis Test as a diagnostic tool for subclinical mastitis in quarter somatic cell count estimation

O "California Mastitis Test" (CMT) estima o conteúdo de células somáticas no leite e é interpretado subjetivamente, estabelecendo-se escores que, na maioria dos casos, variam de 1 a 5. O escore 1 indica uma reação completamente negativa e os de 2-5 indicam graus crescentes de resposta inflamatória do úbere, sendo normalmente considerados como indicativos de mastite subclínica. Dependendo da interpretação dos escores, o CMT pode produzir resultados falso-positivos ou falso-negativos. Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a sensibilidade e a especificidade do CMT em relação à contagem de células somáticas (CCS). Foram utilizadas 3.012 amostras de leite provenientes de 760 vacas Holandesas ou mestiças Holandês-Zebu, pertencentes a 15 rebanhos. Todas as amostras foram submetidas ao CMT e processadas para CCS em equipamento Fossomatic 90. Os valores médios de CCS (x 1.000 células/ml) obtidos para os escores de CMT foram 1 (79,9), 2 (333,5), 3 (670,3), 4 (1.354,0) e 5 (4.455,6). Três opções de interpretação (doente/não-doente) para o CMT foram testadas, em relação aos valores de CCS, iniciando com 100.000 células/ml: (a) 1 versus 2, 3, 4, e 5; (b) 1 e 2 versus 3, 4 e 5; (c) 1, 2, 3 versus 4 e 5. As sensibilidades do CMT em identificar corretamente quartos mamários acima de 200.000 células/ml foram 79%, 61% e 34%, para as opções a, b e c, respectivamente. Para identificar corretamente contagens acima de 500.000 células/ml, as sensibilidades do CMT, para as opções a, b e c, foram, respectivamente: 93%, 82% e 54%. A sensibilidade do CMT em identificar quartos mamários com mastite subclínica foi adequada (acima de 80%) quando a interpretação do teste foi mais rigorosa (opções a e b). A interpretação da reação 3 como negativa (opção c) só alcançou sensibilidade de 80% para contagens entre 1.200.000 e 1.400.000 células/ml. As especificidades do CMT, para CCS de 200.000 e 500.000 foram, respectivamente, 90% e 80% (opção a), 97% e 90% (opção b) e 99% e 97% (opção c)

Detecção de soroalbuminas e imunoglobulinas no leite bovino como indicadores de mastite subclínica / Evaluation of serum albumin and immunoglobulins in bovine milk as an indicator of subclinical mastitis

Com o objetivo de verificar a utilidade da detecção de soroalbumina (BSA) e imunoglobulinas (Ig) no leite como diagnóstico da mastite subclínica, avaliou-se a relação entre a concentração dessas proteínas, o exame microbiológico e o teste "California Mastitis Test" (CMT). Amostras de leite de 172 quartos mamários previamente examinadas pelo CMT foram colhidas e levadas imediatamente ao laboratório para exames bacteriológicos. Uma alíquota de cada amostra foi congelada a -20°C e posteriomente testada para a presença de BSA e Ig, por meio da técnica de imunodifusão radial simples. Das amostras testadas, 111 apresentaram níveis fisiológicos de BSA (< 0,2mg/ml) e de Ig (< 0,5 mg/ml), 22 apresentaram níveis elevados de ambas proteínas e 39 apresentaram níveis elevados de Ig, mas níveis fisiológicos de BSA. Concentrações de BSA e Ig acima dos limites fisiológicos foram observadas mais frequentemente em amostras onde o CMT apresentou reação de maior severidade (+++) e naquelas onde foram isoladas Streptococcus spp. e Staphylococcus aureus. Entre as 88 amostras positivas no exame bacteriológico, níveis de BSA e Ig acima do limite fisiológico foram observados em 10 e 35, respectivamente. Em amostras onde não se isolou bactérias (84 das 172 examinadas), níveis fisiológicos de BSA e Ig foram observados em 72 e 58 delas, respectivamente. A detecção de BSA e Ig nas amostras de leite forneceu informações adicionais sobre o grau de lesão tecidual, mas não pode ser considerada como um indicador sensível para detecção precoce da reação inflamatória.

This work aimed to evaluate the feasibility of milk serum albumin (BSA) and immunoglobulin (Ig) detection for the diagnosis of subclinical mastitis. Bacteriological examinations and concentrations of BSA and Ig were determined in 172 milk samples. The samples were also examined by the California Mastitis Test (CMT). Immediately after collection, the samples were taken to the laboratory and bacteriologically examined. An aliquot of each sample was kept at -20°C and later, concentrations of BSA and Ig were determined by radial immunodiffusion. A total of 111 milk samples had physiological levels of BSA (< 0.2 mg/ml) and Ig (< 0.5mg/ml). Twenty-two samples had higher levels of both proteins and 39 samples had higher levels of Ig and physiological levels of BSA. Concentrations of BSA and Ig above the physiological levels were more frequently observed in quarters samples with severo (+++) CMT reaction and udder infection caused by Streptococcus spp and Staphylococcus aureus. In bacteriologically positive quarters (88 out of 172), increased levels of BSA and Ig were found in 10 and 35 samples, respectively. In the bacteriologically negativo quartors (84 out of 172), physiological levels of BSA and Ig were found in 72 and 58 samples, respectively. Although BSA and Ig measurements in milk samples gave further information about udder tissue damage, they can not be used as a sensitive parameter to detect early inflammatory reaction.