Protocolo para la certificación por conformidad genética de clones en jardines de propagación de caucho (Hevea brasiliensis) / Protocol for the certification by genetic conformity of clones in rubber propagation gardens (Hevea brasiliensis)

RESUMEN A partir de visualización por electroforesis capilar de 9 regiones micro-satélites amplificadas con cebadores fluoromarcados se determinó el polimorfismo de los marcadores Hmct5, 102, HV 30, 548, HV 15, 416, m574, 103 y 358 identificados en el ADN de muestras de tejido foliar de 12 clones de caucho (Hevea brasiliensis) conservados en jardines clonales de AGROSAVIA en Colombia y 25 clones en jardines clonales de origen en Brasil. Con base en los resultados del análisis se consolidó una base de datos que permite corroborar la identidad por conformidad de clones de caucho a partir de muestras foliares. El protocolo establecido consiste en una aproximación metodológica para la amplificación de dichas regiones micro-satélites por PCR punto final y la visualización de los fragmentos obtenidos de este procedimiento por electroforesis capilar multiplexada, reduciendo costos y optimizando el tiempo en laboratorio. Adicionalmente se encontraron discrepancias entre el perfil electroforético obtenido del clon FX 3864 muestreado en Colombia con el obtenido en Brasil. Se propone considerar la necesidad de corroborar la identidad de los clones reproducidos en jardines clonales para su comercialización en Colombia, utilizando metodologías sensibles y reproducibles, como la estandarizada en este estudio.

ABSTRACT The polymorphism of 9 regions identified in the DNA of leaf tissue sampled from 12 rubber clones conserved in clonal gardens of AGROSAVIA in Colombia and 25 clones in clonal gardens of origin in Brazil was visualized by capillary electrophoresis after amplification with the fluorolabeled primer microsatellite markers Hmct5, 102, HV 30, 548, HV 15, 416, m574, 103 and 358. Upon the results analysis, a database was consolidated that allows to corroborate the genetical identity by conformity with 37 rubber clones from leaf samples. The established protocol is a methodological approach using end-point PCR towards the amplification by multiplexed capillary electrophoresis of micro-satellite regions and their visualization, reducing costs and optimizing time in the laboratory. Additionally, discrepancies were found between the electrophoretic profile obtained from clone FX 3864 sampled in Colombia with that obtained in Brazil. It is proposed to consider the need to corroborate the identity of the clones reproduced in clonal gardens for their commercialization in Colombia, using sensitive and reproducible methodologies, such as the one standardized in this study.

Genetic diversity and population structure of the Guinea pig (Cavia porcellus, Rodentia, caviidae) in Colombia

The aim was to establish the genetic diversity and population structure of three guinea pig lines, from seven production zones located in Nariño, southwest Colombia. A total of 384 individuals were genotyped with six microsatellite markers. The measurement of intrapopulation diversity revealed allelic richness ranging from 3.0 to 6.56, and observed heterozygosity (Ho) from 0.33 to 0.60, with a deficit in heterozygous individuals. Although statistically significant (p < 0.05), genetic differentiation between population pairs was found to be low. Genetic distance, as well as clustering of guinea-pig lines and populations, coincided with the historical and geographical distribution of the populations. Likewise, high genetic identity between improved and native lines was established. An analysis of group probabilistic assignment revealed that each line should not be considered as a genetically homogeneous group. The findings corroborate the absorption of native genetic material into the improved line introduced into Colombia from Peru. It is necessary to establish conservation programs for native-line individuals in Nariño, and control genealogical and production records in order to reduce the inbreeding values in the populations.

Caracterización molecular de tres líneas de Cavia porcellus mediante la aplicación de AFLP / Molecular characterization of three populations of Cavia porcellus with AFLP markers

Los marcadores moleculares son una herramienta eficaz para determinar variabilidad genética entre y dentro de poblaciones, pero en el caso de Cavia porcellus, no existen reportes referentes al uso de estas técnicas. Con los marcadores moleculares AFLP´s (Amplified Fragment Length Polimorphism), se analizaron tres poblaciones, dos criollas y una mejorada genéticamente, sometida a selección durante varias generaciones y obtenida a partir del cruzamiento entre animales peruanos y nativos de Nariño. Para obtener los marcadores moleculares AFLP´s (Amplified Fragment Lenght Polimorphism), se utilizaron en total cinco combinaciones de cebadores, tres combinaciones recomendadas para el orden Rodenthia y dos por la casa fabricante del Kit, de las cuales sólo una de ellas, con 116 loci, permitió establecer diferencias entre las poblaciones estudiadas, de acuerdo con el valor de distancia genética insesgada de Nei (p<0.01). Las dos poblaciones criollas constituyeron un grupo estrechamente relacionado y distante de la población mejorada genéticamente, lo que indica que los animales importados absorbieron al criollo. De acuerdo con los valores de heterocigosidad promedio, que variaron entre 0.48% y 14.48%, y el porcentaje de polimorfismo que osciló entre 0.00% y 39.65%, se deduce una baja variabilidad intrapoblacional, siendo la población mejorada genéticamente la más polimórfica. La baja variabilidad entre los animales mejorados, se explica por la intensa selección a la que han sido sometidos, mientras que en los núcleos criollos este fenómeno puede atribuirse al bajo tamaño efectivo en las dos poblaciones. Los resultados de esta investigación sugieren un replanteamiento de los programas de mejoramiento genético y conservación de los recursos genéticos autóctonos en la región.

Molecular markers are a powerful tool to determine genetic variability within and among populations, but for the Cavia porcellus there are no reports on the use of these techniques. Three populations, two native and another one, genetically improved which was obtained by crossing native and Peruvian animals and submitted to genetic selection through several generations were analyzed by means of AFLP markers. Five primer’s combinations recommended for Rodenthia were used, but only one allowed to establish significant differences (p<0.01) according to unbiased Nei´s distance Value. Both native populations were grouped in a cluster genetically distant from the genetically improved animals. This showed that foreign animals absorbed the native populations. The average heterosigosity between 0.48% and 14.48% and the percentage of polymorphisms between 0.00% and 39.65% allow to conclude that there was a low variability between the populations, but the population genetically improved was the most polymorphic. The low variability within the improved animals it can be explained because of the intensive selection procedures use with them, whereas within the native populations can be explained because of their very low populations effective size. These results suggest that there is a need to restate the genetic improvement and preservation programs of the native Cavia porcellus in the southwest region of Colombia.

Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP´s) a partir de muestras de sangre almacenadas en tarjetas FTA®para la especie Cavia porcellus Lin. (Rodentia: Caviidae). / Amplified Fragments Length Polymorphisms (AFLP´s) from blood samples stored in FTA® cards for Cavia porcellus

Una manera eficaz de establecer el grado de variabilidad entre y dentro de poblaciones, es a través del análisis de polimorfismos de ADN con marcadores moleculares como los AFLP`s. En este artículo se presenta una metodología que combina la utilización de tarjetas de FTA® (Whatman Bioscience, Cambridge) para colección y conservación de muestras de sangre, con los procedimientos de extracción de ADN y obtención de marcadores AFLP´s, aspectos sobre los cuales no existen antecedentes para la especie Cavia porcellus. Se utilizaron muestras de ADN procedentes de tres poblaciones, dos criollas y una mejorada genéticamente obtenida a partir de un pie de cría procedente del Perú y sometida a selección en Colombia durante varias generaciones. Todos los animales procedieron de la Granja “Botana”, propiedad de la Universidad de Nariño, Pasto-Colombia. Para la detección de polimorfismos en la longitud de los fragmentos (AFLP`s) se utilizaron uno, tres y cinco discos FTA® de 1.2 mm, cada disco con aproximadamente 25 ng de ADN. Los ensayos indicaron que los mejores productos de amplificación, para la visualización de AFLP´s, se obtuvieron de muestras con tres discos de FTA por individuo, lo que sugiere que con esta metodología,75 ng de ADN por animal son suficientes para detectar polimorfismos de alta calidad en el genoma de Cavia porcellus. Se recomienda el uso de las tarjetas de FTA para el estudio genético de poblaciones de Cavia porcellus, con las modificaciones metodológicas descritas en este artículo para marcadores AFLP´s.

A methodology that includes the use of FTA® (Whatman Bioscience, Cambridge) to collect and store animals` blood samples and the procedures to extract and to get AFLP markers is presented in this paper. A review of the literature indicates that there are no reports concerning both aspects for the Cavia porcellus case. To reach our goal blood samples of three populations – Two native ones and other genetically improved- were obtained through heart puncture. This blood was stored in the FTA cards in order to extract, purify, amplify and analyze their DNA forms. All of the animals came from “Botana” farm of the Universidad de Nariño, located in Pasto, Colombia. For amplifying the AFLP one, three and five 1.2 mm FTA disks of approximately 75 ng of DNA per disk where used. The tests indicated that the best products to amplify and to visualize the AFLP where those ones obtained from samples of three FTA disks per animal. This suggests that 75 ng of DNA per animal is enough to generate AFLP of high quality in the Cavia porcellus` genome. We recommend the use of FTA cards to carry out genetic analyses in the Cavia porcellus, including the methodology modifications presented in this paper.