Caracterización del perfil quimiosensibilidad y del estado de ampliación génica de un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar / Characterization of chemosensitivity profile gene amplification status of a panel of lung cancer cell lines

En este trabajo se presentan los resultados de un análisis de amplificación génica y de sensibilidad a fármacos antineoplásicos, realizado para un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar. Para los ensayos de quimiosensibilidad las células fueron tratadas durante 48 h con concentraciones variables de taxol, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluoracilo. La citotoxicidad de los fármacos se cuantificó usando el ensayo de reducción de resazurina y se reportó en valores de concentración inhibitoria 50 (CI50). Para los análisis de amplificación génica se emplearon sondas TaqMan® dirigidas contra los genes AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, c-REL y genes de la familia MYC. El número de copias para cada gen fue calculado usando el método de doble delta Ct, empleando ACTB como gen de referencia y la línea MRC-5 como muestra control. Los resultados mostraron que la viabilidad de todas las líneas celulares se afectó por el tratamiento con taxol, cisplatino y doxorrubicina, pero no con el tratamiento con 5-fluoracilo. Las CI50 calculadas se ubicaron entre 0,38 ± 0,03 µM y 111,3 ± 3,58 µM, siendo el taxol y la doxorrubicina los fármacos más potentes. Del panel evaluado las células NCI-H292 resultaron ser las más sensibles y las células LSPG8G las más resistentes a los fármacos. Interesantemente en las células NCI-H292 ningún gen se encontró amplificado; por el contrario en las células LSPG8G los genes cMYC, MYCN, MYCL y AKT2 mostraron un aumento en el número de copias con respecto al de las células control. Estos resultados sugieren que eventos de amplificación génica podrían contribuir con el fenómeno de quimioresistencia en líneas celulares de cáncer de pulmón, sin embargo otros estudios deben realizarse para confirmar esta hipótesis.

In this paper, we show results of anticancer drug sensitivity assays and studies of gen amplification performed for a panel of lung cancer cell lines. For the chemosensitivity assays the cells were treated for 48 h with different concentrations of taxol, cisplatin, doxorubicin and 5-fluorouracil. The cytotoxic effect of each drug was determined using the resazurin reduction assay and reported in terms of inhibitory concentration 50 (IC50). For the analysis of gene amplification we used TaqMan® probes designed against AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, REL and MYC family members. Copy number for each gene was calculated using the delta-delta-CT method, employing ACTB as reference gen and MRC-5 cell line as control sample. In the chemosensitivity assays, we observed a clear decrease in cell viability in the cells treated with taxol, cisplatin and doxorubicin but not in the cells treated with 5-fluorouracil. IC50 values ranging between 0,38± 0,03 µM and 111,3 ±3,58 µM, being the taxol and doxorubicin the most potent drugs. NCI-H292 cell line was the most sensitivity and LSPG8G cell line was the most resistant. Interestingly, NCI-H292 cells did not show increase in the copy numbers for the gene evaluated, in contrast, we observed changes in the gene dosage for cMYC, MYCN, MYCL and AKT2 in LSPG8G cells. These results suggest that gene amplification could contribute to drug resistance in lung cancer cell lines; however, more studies are needed to confirm this hypothesis.

Human papillomavirus (HPV) detected in restored plasma DNA from women diagnosed with pre-invasive lesions and invasive cervical cancer / Detección del virus del papiloma humano (VPH) en ADN de plasma restaurado de mujeres en quienes se diagnosticaron lesiones pre-invasivas y cáncer cervical invasivo

Objective: To improve the sensitivity of Human Papillomavirus (HPV) detection in plasma from high-grade cervical neoplasia patients (CIN III) and cervical cancer (CC) evaluating any likely correlation with disease stage.Method: We subjected plasma DNA isolates from 112 patients (CIN and ICC) to a pre-PCR restoration treatment to improve detection sensitivity. HPV-specific sequences were detected by conventional PCR both in cervical scrapes and plasma DNA obtained from each patient. For every single DNA sample, both non-restored and restored isolates were PCR analyzed.Results: We detected HPV in plasma DNA isolates with significantly higher efficiency on restored plasma-DNA as compared to each non-restored equivalent, still maintaining close correlation with the clinical stage of the cases. By analyzing plasma-DNA isolates we could classify as HPV positive >50.0% of the cases that were previously known to be positive from the cervical scrape based assay. Interestingly, 100% of the cases in which subtype HPV18 was detected in cervical scrapes were also positive in plasma DNA.Conclusions: Restoration of plasma DNA from cervical cancer patients allows a more sensitive PCR-based HPV detection, maintaining the correlation to disease stage traditionally observed.

Objetivo: Mejorar la sensibilidad y la detección del virus del papiloma humano (VPH) en el plasma de pacientes con neoplasias intraepiteliales de alto grado (NIEAG) y cáncer de cuello uterino (CCU) para evaluar si existe una relación con el estadío de la enfermedad.Método: Los ADN de plasma aislados de 112 pacientes (NIC y CCU) se sometieron a restauración mediante reacción de la polimerasa en cadena (siglas en inglés, PCR), para mejorar su calidad como sustrato para PCR. En cada paciente se detectaron secuencias específicas del VPH por PCR convencional, tanto en exudados cérvico-vaginales como en ADN del plasma. Por cada muestra se analizaron por PCR, cantidades equivalentes del ADN aislado, tanto no restaurado como restaurado.Resultados: Para las muestras pareadas se pudo detectar VPH en ADN de plasma de forma más eficiente en los materiales restaurados, pues se mantuvo una estrecha correlación con el estadío clínico de los casos. Mediante el análisis de ADN de plasma es posible detectar como VPH positivas más de 50% de los casos que se identificaron previamente como positivos en citología de cuello uterino. Se enfatiza el hecho que 100% de los casos en los que el subtipo VPH18 fue descubierto en exudado cérvico-vaginal también fueron positivos en el ADN de plasma.Conclusiones: El proceso de restauración de ADN de plasma de pacientes con cáncer de cuello uterino permite mejorar la detección de VPH, por PCR, y mantener la correlación con el estadío de la enfermedad.

Modulación de la diferenciación de células dendríticas por antígenos tumorales pulmonares / Modulation of dendritic cell differentiation by lung tumor antigens

El cáncer es, en la actualidad, un serio problema de salud pública en el ámbito mundial. Una de las aproximaciones más exploradas desde hace cerca de veinte años, es la inmunoterapia con células dendríticas (CD), células presentadoras de antígenos (CPA) profesionales. No obstante, los resultados de los estudios clínicos que emplean CD autólogas pulsadas con antígenos tumorales no han sido tan exitosos como se proyectaba. Una de las hipótesis propuestas que justifique la eficacia tan variable en los protocolos terapéuticos, es la inducción de tolerancia en las CD por los antígenos tumorales y la subsecuente baja actividad de las células efectoras (linfocitos T CD8+, CD4+ y Natural Killer). En este trabajo se evidencia que los antígenos tumorales provenientes de un adenocarcinoma pulmonar favorecen la reaparición de co-receptores como el CD14, conocido marcador de inmadurez en CD. Esto sugiere que en algunos aspectos las CD expuestas a tales antígenos, muestran defectos en la diferenciación. Como se sabe, las CD inmaduras tienen una potencia estimuladora mucho menor sobre las células efectoras, comparativamente con las CD de fenotipo maduro. Sin embargo, antígenos provenientes de la línea comercial A549 (adenocarcinoma) no produjeron cambios similares en la maduración de CD. Ello resalta la necesidad de caracterizar la respuesta individual in vitro al planear una terapia basada en CD, a fin de tener mayor probabilidad de éxito en el tratamiento.

Cancer is currently a very serious public health problem worldwide. Dendritic cell (DC) based immunotherapy has been one of the most active research fields during the last 20 years. However, results of several studies, mainly involving tumor antigen pulsed autologous DCs, have not been as successful as expected. Induction of a tolerant behavior of DCs upon the contact with tumor derived antigens is one of the hypotheses proposed since other effector cells like CD8+, CD4+ T lymphocytes and Natural Killers, would be rendered to a non-responsive state seriously impairing tumor growth control. In this work we found additional evidence about a likely DC differentiation defect caused by lung adenocarcinoma specific antigens freshly obtained from a patient, as suggested by the presence of the co-receptor CD14 on the surface of mature DCs (CD14 is a known marker for initial stages of DC differentiation). Our results confirm that some aspects in tumor antigen treated DCs resemble their immature phenotype, largely less efficient presenting cells, and very weak immune response inducers. Interestingly, tumor antigens obtained from the lung adenocarcinoma derived A549 cell line were unable to cause the same effect. This highlights the requirement for a complete characterization of the functional nd phenotypic individual conditions when planning a DC based immunotherapy in order to have good success likelihood at cancer patient’s treatment.