Histopathological characterization of the reproductive organs of heifers experimentally infected with Campylobacter fetus venerealis / Caracterización histopatológica de los órganos reproductivos de vaquillonas experimentalmente infectadas con Campylobacter fetus venerealis / Caracterização histopatológica em órgãos reprodutores de novilhas infetadas no modo experimental com Campylobacter fetus venerealis

Abstract Background: Bovine campylobacteriosis is a venereal disease due to infection with Campylobacter fetus venerealis. It causes mainly reproductive failures that lead to considerable economic losses. Objective: To perform a histopathological description of the mucosa from reproductive organs of heifers experimentally infected with Campylobacter fetus venerealis. Methods: Twelve 15-18-months-old Aberdeen Angus heifers were treated for estrous synchronization and exposed to natural breeding. They were then randomly divided into two groups: group A (n=9) was inoculated with C. fetus venerealis; group B (n=3, control) was inoculated with a placebo. Ultrasonography was performed at days 29, 38, and 42 post-breeding, and plasmatic progesterone levels were quantified using ELISA to confirm pregnancies. Animals in group A with plasma progesterone levels below 1 ng/mL and/or diagnosed as non-pregnant were further divided into three subgroups: A1 (n=4), euthanized at day 30 post-breeding; A2 (n=3), euthanized at day 40 post-breeding and A3 (n=2), euthanized at day 55 post-breeding. Heifers from group B, all diagnosed as pregnant, were euthanized each at day 30, 40, and 55 days post-breeding as well. Histological sections from every group were taken from oviducts, uterus, and vagina. Results: Lymphocytic inflammation was the most common lesion in all infected heifers. Trophoblast cells were found in the non-pregnant heifers euthanized at days 40, and 55 post-breeding. The inflammatory process with the presence of lymphoid cells probably altered the balance in the activity of maternal lymphoid cells, as well as gene expression of the trophoblast, finally affecting the embryo survival. Conclusion: This work contributes to the understanding of the histopathological process involved in post-mating infection of Campylobacter fetus bovine.

Resumen Antecedentes: La campilobacteriosis bovina es una enfermedad venérea causada por el Campylobacter fetus venerealis, que produce principalmente fallas reproductivas ocasionando grandes pérdidas económicas Objetivo: Describir las características histopatológicas de la mucosa de órganos reproductores de vaquillonas infectadas experimentalmente con Campylobacter fetus venerealis. Métodos: Doce vaquillonas Aberdeen Angus (15 a 18 meses de edad) con celo sincronizado, recibieron servicio natural, e inmediatamente se dividieron aleatoriamente en dos grupos: A (n=9), inoculadas con Campylobacter fetus venerealis; B (n=3; control), inoculadas con placebo. El diagnóstico de preñez se realizó por ultrasonografía a los 29, 38 y 42 días post-servicio; los niveles plasmáticos de progesterona fueron determinados por ELISA. Las vaquillonas del grupo A con niveles de progesterona plasmáticos menores a 1 ng/mL y/o diagnosticadas no preñadas, fueron consideradas para eutanasia y divididas en tres subgrupos: A1-eutanasia día 30 (n=4); A2-día 40 (n=3); y A3-día 55 (n=2) post-servicio. Las vaquillonas del grupo B, diagnosticadas preñadas, fueron eutanasiadas a los 30, 40 y 55 días. Se tomaron muestras de oviductos, útero y vagina. Resultados: Se observó inflamación linfocitaria en la totalidad de muestras del grupo A. Células trofoblásticas fueron encontradas en muestras correspondientes a los grupos A2 y A3. Probablemente, el proceso inflamatorio alteró el equilibrio de las células linfoides maternas y la expresión génica del trofoblasto, afectando la supervivencia embrionaria. Conclusión: Este trabajo contribuye a la comprensión del proceso histopatológico involucrado en la infección poscoital por Campylobacter fetus bovino.

Resumo Antecedentes: A campilobacteriose bovina é uma doença venérea originada pelo Campylobacter fetus venerealis, quem produz principalmente falha reprodutiva e porém grandes perdas económicas. Objetivo: Descrever as características histopatológicas da mucosa dos órgãos reprodutores de novilhas infetadas no modo experimental com Campylobacter fetus venerealis. Métodos: Doze novilhas Aberdeen Angus de 15 até 18 meses com cio sincronizado, receberam serviço natural. Logo após, foram aleatóreamente separados em grupos: A (n=9) inoculados com Campylobacter fetus venerealis e grupo B (n=3; controle) inoculadas com um placebo. O diagnóstico da gestação foi realizado por ultrasom nos dias 29, 38 y 42 pós-serviço. Os níveis plasmáticos da progesterona foram determinados por ELISA. As novilhas do grupo A, com níveis plasmáticos de progesterona menores a 1 ng/mL e/ou diagnosticadas não grávidas, foram consideradas para eutanásia e foram divididas em três subgrupos: A1-eutanásia aos 30 dias pós- serviço (n=4); A2-dia 40 (n=3); A3-dia 55 (n=2). Foram realizada eutanásia ás novilhas do grupo B diagnosticadas prenhadas, aos 30, 40 e 55 dias e a amostragem de ovidutos, útero e vagina. Resultados: A presença de inflamação linfocitária foi observada na totalidade das amostras do grupo A. Foram achadas células trofoblásticas nas amostras correspondente aos grupos A2 e A3. Provavelmente, pelo processo inflamatório tenha sido alterado o equilíbrio das células linfoides maternas, assim também como a expressão gênica do trofoblasto, afetando a supervivência embrionária. Conclusão: Este trabalho contribue á compreensão do processo histopatologico na infecção com Campylobacter fetus bovino pós-acasalamento.

Characterization of the Campylobacter fetus subsp. venerealis adhesion to bovine sperm cells / Caracterización de la adhesión de Campylobacter fetus subsp. venerealis a espermatozoides bovinos

Campylobacter fetus is extracellular bacteria of the genital tract of cattle. They cause infertility and abortion, but there is no documented information on the susceptibility of bovine sperm cells to this bacteria. The aim of this present work was to study the effects provoked by Campylobacter fetus subsp. venerealis when in interaction with bovine sperm cells. The bovine spermatozoa were obtained frozen bovine semen pooled from uninfected bulls, and were exposed to living campylobacter over different periods of time. Light microscopy and scanning electron microscopy first revealed a tropism, then a close proximity followed by tight adhesion between these two different cells. A decrease in the spermatozoa motility was observed. Motile bacteria were observed during the next 3 h, this process began with a tight membrane­membrane adhesion. The adhesion between Campylobacter fetus to the sperm cell occurred either by the flagella or by sperm head. Results from this study demonstrated with light microscopy scanning electron microscopy allowed us to characterize some aspects of the interaction of Campylobacter fetus subsp. venerealis and bovine sperm while preserving the cellular and bacterial structure. This ex vivo model might be useful for studies on adhesion and cytopathogenicity of different field strains of Campylobacter fetus.

Campylobacter fetus subsp. venerealis es un patógeno extracelular del tracto genital de bovinos. En las hembras causa subfertilidad y aborto, mientras que los toros son portadores en el esmegma prepucial y se desconoce si provoca daño en los espermatozoides. El objetivo del presente trabajo fue estudiar los efectos de Campylobacter fetus subsp. venerealis sobre espermatozoides bovinos. Los espermatozoides obtenidos a partir de pajuelas de semen pertenecientes a toros no infectados, se coincubaron con una cepa de Campylobacter fetus subsp. venerealis por diferentes períodos de tiempo. Por microscopía óptica y electrónica de barrido se observó el tropismo inicial de la bacteria hacia los espermatozoides y la adhesión bacteriana, de forma colateral se observó su efecto en el espermograma. Post incubación los espermatozoides presentaron menor motilidad progresiva y mayor porcentaje de muertos con respecto al control. Se comprobó la viabilidad de la bacteria a las 3 h. Se registró la adhesión de Campylobacter fetus subsp. venerealis a la membrana celular de distintas porciones del espermatozoide: cabeza, pieza media, cuello y cola. Los resultados de este estudio permitieron caracterizar la interacción entre Campylobacter fetus subsp. venerealis y espermatozoides bovinos por microscopía óptica y electrónica de barrido. La aplicación de este modelo ex vivo permitirá profundizar los conocimientos referentes a los procesos de adhesión y citopatogenicidad de Campylobacter fetus.

Quantitative analysis of campylobacter fetus venerealis adhesion to bovine reproductive tract cell cultures / Análise quantitativa da adesão de campylobacter fetus venerealis em culturas de células do aparelho reprodutor bovino

Campylobacter fetus is the etiological agent of bovine genital campylobacteriosis, a sexually transmitted disease which is associated with reproductive losses in bovines. Campylobacter colonizes the vagina and the uterus and then infects the epithelial cells of the endometrium. The objective of this work was to develop an ex vivo model to quantify the adhesion of Campylobacter to its natural specific target cells; this is a key step for the establishment of infection and studies regarding the adherence and cytotoxicity on the natural host cells are not available. The assays were carried out by seeding Campylobacter fetus venerealis on bovine vaginal and uterine epithelial cell cultures. HeLa cells were used as control. Bacterial adhesion was corroborated by optical microscopy and determination of the percentage of adherent bacteria was performed on immunochemically-stained slides. Results are presented as percentage of cells with adherent Campylobacter and as number of bacteria per cell. In comparison to the control HeLa cells, the statistical analysis revealed that primary cultures show a higher percentage of infected cells and a lower variation of the evaluated parameters. This primary culture model might be useful for studies on cytopathogenicity and adhesion of different field strains of Campylobacter fetus.

Campylobacter fetus é o agente etiológico da campilobacteriose genital bovina, uma doença sexualmente transmissível que está associada com perdas reprodutivas em bovinos. Campylobacter coloniza a vagina e o útero e então infecta as células epiteliais do endométrio. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo ex vivo para quantificar a adesão de Campylobacter às células-alvo naturais específicas; este é um passo fundamental para o estabelecimento da infecção e estudos acerca da adesão e citotoxicidade sobre as células do hospedeiro natural não estão disponíveis. Os ensaios foram realizados a través da semeadura de Campylobacter fetus venerealis em culturas celulares epiteliais vaginais e uterinas.Células HeLa foram utilizadas como controle.A aderência bacteriana foi confirmada por microscopia óptica e a determinação da porcentagem de bactérias aderidas foi realizada em lâminas tingidas imunoquimicamente. Os resultados são apresentados como porcentagem de células com Campylobacter aderente e como o número de bactérias por células. Em comparação com as células HeLa controle, a análise estatística revelou que as culturas primárias mostram uma maior porcentagem de células infectadas e uma menor variação dos parâmetros avaliados. Este modelo de cultura primária pode ser útil para estudos sobre citopatogenicidade e adesão de diferentes cepas de campo de Campylobacter fetus.

Experimentally induced intravaginal Tritrichomonas foetus infection in a mouse model

A necessidade de esclarecer a relação agente-hospedeiro na tricomoníase bovina deu motivo para o uso de modelos experimentais alternativos ao bovino. O camundongo BALB/c resultou como espécie mais adequada para a infeção vaginal com Tritrichomonas foetus, requerendo uma estrogenização prévia. Visando a necessidade de um modelo experimental sem estrogenização persistente e com ciclos estrais normais, foi avaliada a instalação e persistência da infeção vaginal no camundongo BALB/c com diferentes quantidades de T. foetus, em dois grupos experimentais. O Grupo A foi tratado com 5µg de 3-benzoato de beta estradiol, para sincronizar o estro, 48 h antes da inoculação vaginal com T. foetus, e o Grupo B foi inoculado durante o estro natural. O efeito do 3-benzoato de beta estradiol decresceu gradualmente. A totalidade dos animais ciclaram regularmente após 5-7 dias pós-tratamento. Após a primeira semana pós-infecção, todos os animais foram amostrados durante 34 semanas, para avaliar o andamento da infeção vaginal e o estádio de cío. O Grupo A apresentou 93,6% de animais infetados e o Grupo B 38%. Com diferentes dosagens de T. foetus se obteve a instalação e persistência da infecção vaginal durante 34 semanas. Embora tenham-se registrados diferentes comportamentos entre cada um dos lotes dos Grupos A e B, não houveram diferenças significativas entre as doses infectantes. O tratamento com 3-benzoato de beta estradiol teve efeito favorável na instalação da infecção (P<0,0001), porém não teve influência na persistência (P= 0,1097). Em função dos resultados obtidos, apresenta-se um modelo experimental em camundongo, adequado para aprofundar estudos sobre mecanismos de patogenicidade, resposta imune, avaliação protetora de imunógenos e o efeito terapêutico de fármacos.

Immunohistochemical detection of Tritrichomonas foetus in experimentally infected mice

A necessidade de aumentar o conhecimento da patogenia da tricomoníase genital bovina (BGT) conduziu ao uso de modelos experimentais alternativos como o camundongo. Näo obstante, é necessário elucidar a dinâmica da infecçäo nesta espécie e avaliar as diferentes fases da colonizaçäo e evoluçäo das alterações patológicas. A imunohistoquímica (IHQ) oferece vantagens sobre as técnicas histoquímicas de rotina para a observaçäo do protozoário em tecidos, detritos celulares e dentro de macrófagos. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar pelo uso de uma técnica de IHQ a presença de Tritrichomonas foetus no sistema reprodutivo de camundongos infectados. Camundongos BALB/c fêmeas foram infectados pela via intravaginal, com uma suspensäo de T. foetus, na fase de estro, detectado com citologia exfoliativa vaginal. Depois de 10 semanas, os animais foram sacrificados; útero e vagina forma fixados e processados para histologia. Alguns cortes foram corados com HE. O restante dos cortes foi processado para IHQ. Foi usado um soro policlonal imunoadsorvido anti-T. foetus. A técnica de avidina-biotina (HistoMouse, ZymedÖ) foi empregada. Os estudos histopatológicos mostraram uma dilataçäo das glândulas uterinas, presença de macrófagos no lúmen do órgäo e parte interna das glândulas endometriais. T. foetus näo foi identificado por esse método. A IHQ permitiu identificar as mesmas lesões observadas e a presença do protozoário no endométrio, nas glândulas endometriais, no lúmen uterino e dentro de neutrófilos e macrófagos. O estudo citológico em lâminas coradas por IHQ, mostrou T. foetus aderido a células epiteliais, ou dentro de macrófagos. Esta técnica demonstra ser uma ferramenta útil para o estudo da patogenia da tricomoníase genital bovina (BGT) utilizando-se o camundongo como modelo experimental.