Papel de la vacuola parasitófora de macrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis en la adquisición de de moléculas / Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmania amazonensis in molecule acquisition

Introducción. Leishmania son parásitos intracelulares de macrófagos, confinados en compartimentos denominados vacuolas parasitóforas. La permeabilidad de este compartimento depende de su interacción con el tráfico vesicular y transportadores presentes en su membrana. Objetivo. En este trabajo se estudió la permeabilidad de la membrana de la vacuola parasitófora en la línea celular J774.A1 infectada con Leishmania amazonensis, in situ y en compartimentos aislados. Materiales y métodos. El aislamiento de vacuolas parasitóforas se hizo por gradiente de densidad. La permeabilidad de la membrana de estas se valoró por distribución de sondas fluorescentes y electrofisiología. Para establecer indirectamente el transporte de protones se usó naranja de acridina. La presencia de transportadores ABC sensibles a probenecid se estableció con amarillo lucifer y calceína. Por primera vez con la técnica de patch-clamp se registraron corrientes en la membrana de este compartimento aislado. Resultados. La vacuola parasitófora colorea de rojo con naranja de acridina indicando un pH ácido. Concentra amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid, pero excluye la sonda calceína. Vacuolas aisladas se marcan de rojo con naranja de acridina y concentran amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid. Estas vacuolas excluyeron calceína y presentaron en su membrana una corriente iónica que se activa a diferencias de potencial cercanas a 60 mV, con una conductancia de 46 ± 3 pS. Conclusiones. Se pueden aislar vacuolas parasitóforas con propiedades de permeabilidad que preservan mecanismos de transporte similares a los encontrados in situ. Se registra por primera vez la presencia de una corriente iónica poco selectiva en la membrana de este compartimiento.

Introduction. Leishmania are intracellular parasites of macrophages, confined into compartments known as parasitophorous vacuoles. The permeability of this compartment depends on its interaction with the endocytic pathway and transport proteins present on its membrane. Objective. The membrane permeability of the parasitophorous vacuole was studied in J774.A1- macrophage like cells infected with Leishmania amazonensis, in situ and on isolated compartments. Materials and methods. The parasitophorous vacuoles were isolated by density gradients. Fluorescent probe distribution and electrophysiological recordings were used to determine parasitophorous vacuole membrane permeability. Proton transport was evaluated indirectly by acridine orange staining. Probenecid sensitive ABC transporters were detected using the fluorescent probes lucifer yellow and calcein. For the first time ion currents were recorded on the membrane of isolated parasitophorous vacuoles using the patch clamp technique. Results. The parasitophorous vacuole stains red with acridine orange indicating an acidic compartment. It concentrates lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter but excludes calcein. Isolated vacuoles stained red with acridine orange and concentrated lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter. These vacuoles excluded calcein and showed an ion current in their membrane which is activated at potentials close to 60 mV with a mean conductance of 46 ± 3 pS. Conclusions. Isolated parasitophorous vacuoles with permeability properties preserving transport mechanisms similar to those found in situ can be purified. A poorly selective ion current on the parasitophorous vacuole membrane is reported for the first time.

Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania / Genetic manipulation and the study of the protozoan parasite Leishmania

Durante los últimos 15 años se ha dado paso al entendimiento de muchos aspectos de la genómica funcional de Leishmania gracias a los avances en la metodología de transfección de ADN dentro de la célula de este protozoario, la eliminación y la complementación de genes por medio de recombinación homóloga y las estrategias para la selección de células transfectadas. Estos acercamientos tienen el potencial de brindar información sobre la expresión génica y la función de las proteínas en el contexto del parásito intacto. Dado que el genoma de Leishmania muestra una carencia acentuada de los factores conocidos de iniciación de la transcripción y que la expresión génica está regulada casi completamente a nivel postranscripcional (a través del empalme de los ARNm y los mecanismos que involucran el procesamiento diferencial de la región no traducida 3' del ARNm (3'UTR), la transfección génica representa una herramienta útil para la identificación y el análisis funcional de los genes de interés así como de los mecanismos que dirigen su regulación. El desarrollo de los sistemas de manipulación genética también ha abierto nuevos horizontes para la identificación de genes esenciales involucrados en la virulencia, la supervivencia intracelular y la resistencia a drogas de Leishmania, así como para la validación de proteínas específicas del parásito como nuevos blancos quimio e inmunoterapéuticos. En esta revisión presentamos los avances más recientes en el campo de la manipulación genética en Leishmania, los cuales permiten análisis estructurales, funcionales y de fenotipo, por medio de la eliminación y complementación génica a través de la transfección transitoria o permanente de genes en este parásito