Partial characterization of Plasmodium falciparum trophozoite proteome under treatment with quinine, mefloquine and the natural antiplasmodial diosgenone / Caracterización parcial del proteoma del trofozoíto de Plasmodium falciparum bajo tratamiento con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona

Introduction: Despite efforts to control malaria, around 10% of the world population is at risk of acquiring this disease. Plasmodium falciparum accounts for the majority of severe cases and deaths. Malaria control programs have failed due to the therapeutic failure of first-line antimalarials and to parasite resistance. Thus, new and better therapeutic alternatives are required. Proteomic analysis allows determination of protein expression levels under drug pressure, leading to the identification of new therapeutic drug targets and their mechanisms of action. Objective: The aim of this study was to analyze qualitatively the expression of P.falciparum trophozoite proteins (strain ITG2), after exposure to antimalarial drugs, through a proteomic approach. Materials and methods: In vitro cultured synchronized parasites were treated with quinine, mefloquine and the natural antiplasmodial diosgenone. Protein extracts were prepared and analyzed by two-dimensional electrophoresis. The differentially expressed proteins were selected and identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Results: The following proteins were identified among those differentially expressed in the parasite in the presence of the drugs tested: enolase (PF10_0155), calcium-binding protein (PF11_0098), chaperonin (PFL0740c), the host cell invasion protein (PF10_0268) and proteins related to redox processes (MAL8P1.17). These findings are consistent with results of previous studies where the parasite was submitted to pressure with other antimalarial drugs. Conclusion: The observed changes in the P. falciparum trophozoite protein profile induced by antimalarial drugs involved proteins mainly related to the general stress response.

Introducción. A pesar de los esfuerzos para controlar la malaria, esta sigue siendo un problema de salud pública. Plasmodium falciparum es responsable de la mayoría de los casos graves y de las muertes. Los programas de control de la malaria han sido cuestionados debido al fracaso del tratamiento y a la resistencia del parásito a los antipalúdicos de primera línea, por lo que se requieren nuevas y mejores alternativas. El análisis proteómico permite identificar y determinar los niveles de expresión de las proteínas bajo la presión de los medicamentos, lo que posibilita la identificación de nuevos blancos terapéuticos y mecanismos de acción. Objetivo. Analizar cualitativamente la expresión diferencial de proteínas del citosol del trofozoíto de P. falciparum bajo tratamiento con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona mediante una aproximación proteómica. Materiales y métodos. Se trataron trofozoítos sincronizados y cultivados in vitro de P. falciparum (cepa ITG2) con quinina, mefloquina y el compuesto natural diosgenona. Los extractos proteicos se prepararon y analizaron por electroforesis bidimensional. Las proteínas con aparente expresión diferencial se seleccionaron e identificaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Resultados. Se encontraron las siguientes proteínas diferencialmente expresadas en el trofozoíto: la enolasa (PF10_0155), la proteína de unión a calcio (PF11_0098), la chaperonina (PFL0740c), la proteína de invasión a la célula del huésped (PF10_0268) y la proteína relacionada con procesos de reducción y oxidación (redox) (MAL8P1.17). Estos hallazgos son congruentes con resultados previos de estudios en los que el parásito fue presionado con otros medicamentos antipalúdicos. Conclusión. Los cambios observados en el perfil de proteínas del trofozoíto de P. falciparum tratado con antipalúdicos involucraron preferencialmente proteínas relacionadas con la respuesta al estrés general.

MÉTODOS PROTEÓMICOS APLICADOS AL ESTUDIO DE LA MALARIA: Plasmodium falciparum / Proteomics Methods Applied to Malaria: Plasmodium falciparum

La malaria es una de las enfermedades parasitarias que causa mayor impacto en la salud pública en países en desarrollo. La secuenciación del genoma de Plasmodium falciparum y el desarrollo de la proteómica han permitido un gran avance en el conocimiento de la biología del parásito. La proteómica ha permitido caracterizar cualitativa y cuantitativamente la expresión de proteínas del parásito y ha proveído información de la expresión relativa de proteínas bajo condiciones de estrés como presión por antimaláricos. Dada la complejidad de su ciclo de vida, el cual se lleva a cabo en el hospedero vertebrado y el mosquito, se ha caracterizado la expresión de proteínas para cada estadio del parásito con el fin de determinar el proteoma que media diversos procesos metabólicos, fisiológicos y energéticos. Técnicas de electroforesis bidimensional, cromatografía líquida y espectrometría de masas, han sido útiles para evaluar los efectos de antimaláricos sobre la expresión de proteínas del parásito y caracterizar el proteoma de diferentes formas y organelas de P. falciparum. El propósito de esta revisión es presentar el estado del arte de los avances en proteómica aplicada al estudio de la malaria, y plantear las diferentes estrategias experimentales empleadas para el estudio del proteoma del parásito con el fin de describir las ventajas y desventajas de cada una de estas metodologías.

Malaria is a parasitic disease that has a high impact on public health in developing countries. The sequencing of the Plasmodium falciparum genome and the development of proteomics have enabled a breakthrough in understanding the biology of the parasite. Proteomics have allowed to characterize qualitatively and quantitatively the parasite s expression of proteins and has provided information on protein expression under conditions of estrés induced by antimalarials. Given the complexity of their life cycle, which takes place in the vertebrate host and mosquito vector. It has proven difficult to characterize the protein expression during each stage throughout the infection process in order to determine the proteome that mediates several metabolic, physiological and energetic processes. Two dimensional electrophoresis, liquid chromatography and mass spectrometry have been useful to assess the effects of antimalarials on parasite protein expression and to characterize the proteomic profile of differentt P. falciparum stages and organelles. The purpose of this review is to present state of the art tools and advances in proteomics applied to the study of malaria, and to present different experimental strategies used to study the parasite's proteome in order to show the advantages and disadvantages of each one.

Influence of Mg2+ ions on the interaction between 3,5-dicaffeoylquinic acid and HTLV-I integrase / Influencia de los iones Mg+2 sobre la interacción entre el ácido 3,5- dicafeoilquínico y la integrasa del HTLV-I / Influência dos íons Mg2+ sobre a interação entre o ácido 3,5-dicafeoilquínico e a integrase do HTLV-I

Objective. Using molecular simulation, we studied the influence of Mg2+ ions on the binding mode of HTLV-I Integrase (IN) catalytic domain (modeled by homology) with the 3,5- Dicaffeoylquinic Acid (DCQA). HTLV-I Integrase homology model was built using template-like crystallographic data of the IN catalytic domain solved for Avian Sarcoma Virus (VSA, pdb: 1VSD). Materials and methods. In order to analyze the role of Mg2+ in the interaction or coupling between 3,5-DCQA and Integrase, three models were created: i) in the absence of Mg2+ ions, ii) with a Mg2+ ion coordinated at Asp15 and Asp72 and iii) model with two Mg2+ ions coordinated at Asp15-Asp72 and Asp72-Glu108. Coupling force and binding free energy between 3,5-DCQA and HTLV-I IN were assessed in the three models. Results. The lowest docking score and free energy binding were obtained for the second model. Mg2+ ion strongly affected the coupling of the inhibitor 3,5-DCQA with HTLV-I catalytic domain of Integrase, thus revealing a strong interaction in the ligand-protein complex regardless of the ligand-catalytic interaction sites for all three models. Conclusion. Altogether, these results strengthen the hypothesis that the presence of one Mg2+ ion could enhance the interaction in the complex by decreasing free energy, therefore increasing the affinity. Moreover, we propose 3,5-DCQA as an important pharmacophore in the rational design of new antiretroviral drugs.

Objetivo: Usando simulación molecular, estudiamos la influencia de los iones Mg2+ en la interacción del dominio catalítico de la integrasa HTLV-I (IN) (modelado por homología) con el ácido 3,5-Dicafeoilquínico (DCQA). Materiales y métodos. El modelo por homología de la HTLV-I IN fue construido usando como molde la estructura cristalina de la IN del virus del sarcoma aviar (VSA, pdb: 1VSD). Para analizar el rol de los iones Mg2+ en la interacción con el DCQA y la integrasa, tres modelos fueron creados: i) en ausencia de iones Mg2+, ii) con un ion Mg2+ coordinado con Asp15 y Asp72 y iii) con dos iones Mg2+ coordinados con Asp15-Asp72 y Asp72-Glu108. Las fuerzas de interacción y la energía libre de unión entre el DCQA y la HTLV-I IN fueron calculadas en los tres modelos. Resultados. El puntaje más bajo en el docking y la menor energía libre fueron obtenidos para el modelo con un solo ion de Mg2+. El Mg2+ afecta fuertemente el acoplamiento del inhibidor DCQA con el dominio catalítico de la HTLV-I IN, revelando una fuerte interacción entre el complejo ligando-proteína que es independiente del sitio catalítico de los tres modelos usados. Conclusión. Los resultados sugieren que la presencia de un ion de Mg² + podría incrementar la interacción en el complejo debido a la disminución de la energía libre, intensificando así la afinidad. Por lo que, proponemos al DCQA como farmacóforo para el diseño de drogas antiretrovirales.

Objetivo. Usando simulação molecular, estudamos a influência dos íons Mg2+ na interação do domínio catalítico da integrase HTLV-I (IN) (modelado por homologia) com o ácido 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA). Materiais e métodos. O modelo de homologia da HTLV-I IN foi construído utilizando como fôrma a estrutura cristalina da IN de vírus do sarcoma aviário (VSA, pdb: 1VSD). Para analisar o papel dos íons Mg2+ na interação com o 3,5-diCQA e a integrase, três modelos foram criados: i) na ausência de íons Mg2+, ii) com um íon Mg2+ coordenado com Asp15 e Asp72 e, iii) com dois íons Mg2+ coordenados com Asp15-Asp72 e Asp72-Glu108. As forças de interação e a energia livre de ligação entre o 3,5-diCQA e a HTLV-I IN foram calculadas nos três modelos. Resultados. A pontuação mais baixa no docking e a menor energia livre foram obtidas para o modelo com um único íon de Mg2+. O Mg2+ afeta fortemente o acoplamento do inibidor 3,5-diCQA com o domínio catalítico da HTLV-I IN, revelando uma forte interação entre o complexo ligando-proteína que é independente do sítio catalítico dos três modelos utilizados. Conclusão. Os resultados sugerem que a presença de um íon Mg2+ poderia aumentar a interação no complexo devido à diminuição da energia livre, aumentando assim a afinidade. Assim, propomos ao 3,5-diCQA como farmacóforo para a fabricação de medicamentos antirretrovirais.

Expansión clónica y caracterización genómica del proceso de integración del virus linfotrópico humano tipo I en la leucemia/linfoma de células T en adultos / Clonal expansion and genomic characterization of the human T-cell lymphotropic virus type I during the integration process in adult T-cell leukemia/lymphoma

Introducción. Aunque la integración del virus linfotrópico humano tipo I no es al azar, se desconocen muchos de los detalles de este proceso. Objetivo. Evaluar las características de la cromatina celular adyacente a secuencias provirales en pacientes con leucemia/linfoma de células T en adultos asociada al virus. Materiales y métodos. Se extrajo el ADN de biopsias de siete pacientes colombianos con leucemia/linfoma de células T en adultos y positivos para el virus linfotrópico humano tipo I. Éste se amplificó mediante reacción inversa en cadena de la polimerasa, para determinar el grado de expansión clónica y su composición de nucleótidos. A partir de 61 secuencias de ADN humano adyacentes a provirus, provenientes de pacientes leucémicos colombianos y japoneses, se efectuó un análisis in silico para obtener datos sobre su integración, las características de la cromatina y sus funciones asociadas. Resultados. La expansión de clones celulares fue predominantemente oligoclónica. De las 61 secuencias de ADN adyacente a provirus, se seleccionaron 155 alineamientos que cumplieron con los criterios de inclusión (homologías≥95%, e-value≤0,05). De éstos, 74,84% fueron secuencias no codificantes repetidas y no repetidas. El 45,95% de las integraciones provirales se localizó en los cromosomas de los grupos A y B. Se observaron tendencias de integración hacia exones de genes que se replican tempranamente, regulan el ciclo celular y participan en la transducción de señales. Conclusiones. Los resultados permiten postular que la integración del virus linfotrópico humano tipo I se dirigiría hacia un ambiente genómico caracterizado por elevado contenido de C:G, genes de replicación temprana que regularían el ciclo celular y la transducción de señales.

Introduction. Although the integration of human T-cell lymphotropic virus type I into the T-cells is not a random process, the mechanistic details are not understood. Objectives. The characteristics of the flanking host chromatin were evaluated at the integration sites in adult T-cell leukaemia/lymphoma (ATLL) patients infected with the virus. Materials and methods. From seven leukemic Colombian patients positive for the human T-cell lymphotropic virus type I (HTLV-I), lymphocyte DNA samples were extracted and amplified by inverse polymerase chain reaction (IPCR). Clonal expansion and human genome nucleotide composition in an extension of 50 bp was determined. To establish the characteristics of the human genome flanking provirus, 61 IPCR sequences from Colombian and Japanese ATLL patients, were analyzed in silico to obtain insights about the genomic structure, functions and nature of associated chromatin. Results. The clonal expansion of cell clones was predominantly oligoclonal. From 61 IPCR sequences, 155 alignments with homology higher than 95% (e-value <0.05) were screened. Seventy-five percent of those sequences corresponded to non coding elements that include repetitive and non-repetitive DNA. Fifty percent of the proviral integrations were associated with chromosomes of A and B groups. Viral DNA integration tended to favor exons of genes that replicated early, controlled the cell cycle, or were involved in signal transduction. Conclusions. The results indicated that HTLV-I integration was preferentially directed towards genomic environments with high C:G content, and toward genes that replicate early, regulate cell cycle or involved with signal transduction.

Modelación molecular y variación estructural de las integrasas de dos retrovirus humanos: HTLV-I y VIH-1 / Molecular modeling and structural variation of two human retrovirus integrases: HTLV-I and HIV-1

Objetivo: Analizar las características moleculares y de variación de secuencias de las integrasas del HTLV-I y del VIH-1 y sus variantes poblacionales. Metodología: Análisis de secuencias y estructuras obtenidas de diferentes bases de datos; para ello se utilizaron programas computacionales de modelación de estructuras proteicas e identificación de sustituciones polimórficas en secuencias de aminoácidos de integrasas del HTLV-I y VIH-1 previamente reportadas. Materiales y métodos: Tanto la integrasa del HTLV-I como la del VIH-1 son proteínas compuestas por 288 residuos de aminoácidos. Se encontró un parecido de estructuras terciarias entre los dominios catalíticos de las IN de VIH-1, ASV y RSV con la del HTLV- I. A partir de 103 secuencias completas de la integrasa del VIH-1 se registraron, en 46 codones, un total de 53 sustituciones que se localizaron en diferentes posiciones de la proteína nativa; las más frecuentes fueron: N27G (32,1%), A265V (30,1%), L101I (31,1%) y T123A (27,0%). Ninguna de las sustituciones más frecuentemente encontradas generó un cambio en el plegamiento nativo de la correspondiente región. Conclusión: La estructura tridimensional del dominio central catalítico de la integrasa condicionaría su actividad y su relación con moléculas potencialmente inhibidoras. Las sustituciones observadas fueron neutrales sin alterar la estructura nativa. Los resultados obtenidos confirman que la integrasa es un nuevo y promisorio blanco para el desarrollo de terapias antirretrovirales más efectivas en el siglo XXI...

Objective: To analyze the molecular characteristics and aminoacid sequence variations of HTLV-I and of HIV-1 integrases and their population variants. Materials and methods: Data mining and analysis of integrase sequences and protein structure data bases by using appropriate software for modelling and search for polymorphic substitutions in HTLV-I and HIV-1 integrase amino acid sequences previously reported. Results: HTLV-I and HIV-1 integrases are proteins of 288 amino acid residues. Structural modeling of tertiary folding of HTLV-I integrase catalytic central domain’s, showed closed structural characteristic with those of HIV-1, ASV and RSV. From 103 full amino acid sequences of HIV-1 integrase, 53 substitutions located in 46 different codons were recorded. The more frequents correspond to N27G (32,1%), L101I (31,1%), A265V (30,1%) and T123A (27,0%). None of these frequent substitutions introduced changes in the folding of HIV-1 native integrase. Conclusion: The tridimensional structure of central catalytic domain would influence the integrase activity and its relationship with potentially inhibitory molecules. Those observed aminoacid substitutions were neutral and do not alter the native protein structure. Our data confirm those previously published, and enable us to propose that IN is a new and promissory target for develop more effective antiviral therapies in the XXI century...