ABSTRACT
En el presente estudio se identificaron proteínas de expresión constitutiva, como vimentina, actina, tubulina, proteína de choque térmico de 60 kDa, peroxirredoxina y la ATP sintasa mitocondrial, en cultivos primarios de tiroides normales y de carcinoma papilar de tiroides. Se establecieron las condiciones de extracción, solubilización, análisis cuantitativo y cualitativo de dichas proteínas, y se buscaron las mejores condiciones de isoelectroenfoque (IEF) en la electroforesis en dos dimensiones (2D). En la extracción y solubilización de las proteínas se evaluó la presencia o ausencia de anfolitos y sales, se obtuvo un mejor resultado empleando en el amortiguador de extracción sales como Tris-HCl y acetato de magnesio que incrementan la solubilidad de las proteínas. Para la cuantificación se recomienda el uso conjunto de técnicas colorimétricas con la electroforesis SDS-PAGE tiñendo con azul de Coomassie y corroborando los resultados mediante western blot, lo cual permite, además, verificar la integridad de las proteínas. Respecto a la electroforesis en dos dimensiones, se obtuvieron geles con un mayor número de manchas (spots),resueltos, enfocados y reproducibles empleando en el IEF gradientes inmovilizados de pH de 4-7 y voltaje final de 8.000 V. Las proteínas se identificaron mediante el análisis bioinformático de los geles 2D con el programa PDQuest (PDQuest 7.2, Bio-Rad®) y MALDI-TOF.
In this paper, proteins of constitutive expression such as vimentin, actin, tubulin, heat shock protein of 60 kDa, peroxiredoxin and the mitochondrial ATP sintase were identified in primary cultures of normal thyroid and papillary carcinoma. The extraction conditions, solubilization, quantitative and qualitative analysis of such proteins were established. In addition, the best conditions for isoelectrofocusing (IEF) in the two-dimensional electrophoresis (2D) were founded. In the extraction and solubilization of proteins, the presence or absence ofampholytes or salts was evaluated. The best result in the extraction was obtained using buffer salts such as Tris-HCl and magnesium acetate, which increase the solubility of these proteins. For quantification, the recommendation is to combine colorimetric techniques with SDS-PAGE electrophoresis stained with Coomasie blue and Western blot to confirm the results, which allows verifying the integrity of these proteins. In the two-dimensional electrophoresis, resolved, focused and reproducible gels with greater number of spots were obtained using in the IEF immobilized pH gradients of 4-7 and final voltage of 8000 V. The proteins were identified by the bioinformatic analysis of the 2DE gels with the PDQuest program (PDQuest 7.2 (BioRad®) and MALDI-TOF.
Neste estudo, se identificaram proteínas da expressão constitutiva, como vimentina, actina, tubulina, proteína de choque do calor do kDa 60, peroxiredoxinaeasintase mitocondrial do ATP, em cultivos primários de tireóide normal e de carcinoma papilar de tireóide. Se estabeleceram as condições de extração e de solubilization, assim como a análise quantitativaeaqualitativa de tais proteínas, e procuraram-se asmelhores condições para isoeletroenfoque (IEF) na eletroforese bidimensional (2D). Na extração e no solubilization das proteínas, se avaliou a presença ou a ausência de anfolitos ou de sais. O melhor resultado foi obtido usando sais como Tris-HCl e acetato do magnésio no amortecedor da extração, as quais aumentam a solubilida-de das proteínas. Na quantificação, se recomenda o uso de técnicas colorimétricas com eletroforese SDS-PAGE, tingindo com azul de Coomasie. Os resultados se confirmam com Western blot, o qual permite também verificar a integridade das proteínas. Quanto à eletroforese bidimensional, se obtiveram géis com um maior número de pontos (spots) determinados, enfocados e reprodutíveis no IEF usando gradientes imobilizados de pH 4-7 e tensão final de 8000 V. As proteínas foram identificadas por análise bioinformática de géis 2D com o programa PDQuest (PDQuest 7.2 (Bio-Rad®) e MALDITOF.