Cryopreservation of Agaricus blazei in liquid nitrogen using DMSO as cryoprotectant / Criopreservação de Agaricus blazei em nitrogênio líquido usando DMSO como crioprotetor

The preservation of Agaricus blazei is generally done using successive subcultivations that are laborious and are subject to contaminations or genetic degenerations, resulting in loss of biotechnological interest characteristics. An alternative process would be cryopreservation, but there are no reports of methodologies for this basidiomycete in liquid nitrogen. Thus, the objective of this study was to evaluate mycelial viability of A. blazei strains after cryopreservation in liquid nitrogen in order to establish the initial parameters of species preservation. Five strains grown on malt extract agar (MEA) were used. Disks of MEA containing A. blazei mycelium were transferred for screwcap cryovials containing the cryoprotectant, 10% dimethyl sulfoxide. Then, they were cooled at 8 ºC for 30 min and kept at -196 ºC with liquid nitrogen. After 1.5 year of cryopreservation, the cryovials were thawed in water bath at 30 ºC for 15 min. The disks with mycelia were transferred to MEA culture media without cryoprotectant and kept at 28 ºC for 30 days. A. blazei strains respond differently to the cryopreservation method at -196 ºC by varying mycelial viability recovery. Cryopreservation with liquid nitrogen, using dimethyl sulfoxide as cryoprotectant, is not the most appropriate one for A. blazei preservation.

A preservação de Agaricus blazei ocorre usualmente por subculturas sucessivas que são laboriosas e estão sujeitas a contaminações ou degenerações genéticas, com eventual perda das características de interesse biotecnológico. Uma alternativa a este processo é a criopreservação, no entanto não existem relatos de metodologias para este basidiomiceto com uso de nitrogênio líquido. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a criopreservação em nitrogênio líquido de linhagens de A. blazei, visando estabelecer os parâmetros iniciais de criopreservação para a espécie. Foram utilizadas cinco linhagens do fungo crescidas em meio de ágar-extrato de malte (MEA). Os discos de MEA contendo o micélio crescido foram transferidos em temperatura ambiente (25 ºC) para criotubos com rosca contendo o agente crioprotetor dimetilsulfóxido a 10%. Em seguida foram resfriados a 8 ºC por 30 min e mantidos a -196 ºC com nitrogênio líquido. Após 1,5 anos de criopreservação os criotubos foram descongelados por imersão em água a 30 ºC por 15 min. Os discos com micélio foram transferidos para meio de cultura MEA, sem o agente crioprotetor, e mantidos por 30 dias a 28 ºC. As linhagens de A. blazei respondem de forma diferente ao processo de criopreservação a -196 ºC com variação na recuperação da viabilidade do micélio. A criopreservação em nitrogênio líquido de A. blazei, com dimetilsulfóxido como crioprotetor, não é a forma mais adequada para a preservação desta espécie.

Production flush of Agaricus blazei on Brazilian casing layers

This study aimed to verify the biological efficiency and production flushes of Agaricus blazei strains on different casing layers during 90 cultivation days. Four casing layers were used: mixture of subsoil and charcoal (VCS), lime schist (LSC), São Paulo peat (SPP) and Santa Catarina peat (SCP); and two genetically distant A. blazei strains. The fungus was grown in composted substratum and, after total colonization, a pasteurized casing layer was added over the substratum, and fructification was induced. Mushrooms were picked up daily when the basidiocarp veil was stretched, but before the lamella were exposed. The biological efficiency (BE) was determined by the fresh basidiocarp mass divided by the substratum dry mass, expressed in percentage. The production flushes were also determined over time production. The BE and production flushes during 90 days were affected by the strains as well as by the casing layers. The ABL26 and LSC produced the best BE of 60.4 percent. Although VCS is the most used casing layer in Brazil, it is inferior to other casing layers, for all strains, throughout cultivation time. The strain, not the casing layer, is responsible for eventual variations of the average mushroom mass. In average, circa 50 percent of the mushroom production occurs around the first month, 30 percent in the second month, and 20 percent in third month. The casing layer water management depends on the casing layer type and the strain. Production flush responds better to water reposition, mainly with ABL26, and better porosity to LSC and SCP casing layers.

Tratamentos térmicos do calxisto para uso como camada de cobertura no cultivo de Agaricus brasiliensis / Thermal treatments on lime schist casing layer for Agaricus brasiliensis cultivation

A escolha da camada de cobertura é uma das mais importantes etapas do cultivo de Agaricus brasiliensis. Apesar dessa importância, poucos estudos relatam o uso de diferentes tratamentos térmicos para o controle da microbiota em camadas de cobertura alternativas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da pasteurização e da autoclavagem do material alternativo calxisto para utilização como camada de cobertura no cultivo de A. brasiliensis. O fungo foi inicialmente crescido em grãos de trigo e transferido para meio de cultivo previamente compostado. Após a completa colonização, a camada de cobertura (calxisto) pasteurizada ou autoclavada foi adicionada. Avaliaram-se a eficiência biológica, o número e a biomassa de cogumelos produzidos e o fluxo de produção. Concluiu-se que a camada de cobertura com calxisto autoclavado reduzem o tempo de produção, a eficiência biológica e o número e a biomassa de cogumelos cultivados. Entretanto, a camada de cobertura com o calxisto pasteurizado é a mais eficiente para o cultivo de A. brasiliensis.

Casing layer choice is one of the most important phases on Agaricus brasiliensis cultivation. Besides the importance of it few studies report the use of different heat treatments to control the microbiota in alternative casing layers. Thus, the objective of this work was to evaluate the effect of pasteurized or autoclaved lime schist as an alternative casing layer on A. brasiliensis cultivation. The fungus was previously grown on wheat grains and transferred to a substratum previously composted. After substratum mycelium colonization a pasteurized or autoclaved lime schist casing layer was added on. It was evaluated the biological efficiency, the number and mass of produced mushroom and the production flush along cultivation. It was concluded that autoclaved lime schist casing layer decreases period of production, biological efficiency, number and mass of cultivated mushrooms. However pasteurized lime schist casing layer is the most efficient on A. brasiliensis cultivation.

Antineoplasic activity of Agaricus brasiliensis basidiocarps on different maturation phases

The fungus Agaricus brasiliensis is a Basidiomycete studied because of its immunomodulation and/or antitumor substances. The objective of this study was to verify the Agaricus brasiliensis antineoplasic activity in vivo on different basidiocarp maturation phases on Sarcoma 180 cells implanted in mice. Sarcoma cells were implanted in mice and after seven days mice were divided in three groups. The first group was treated with saline solution, the second group was treated with closed basidiocarp extract solution and the third group was treated with opened basidiocarp extract solution. After 30 days of being daily orally treated with these three solutions all animals suffered euthanasia, and the splenic index, tumor mass and volume were determined. No significant differences of the tumor growth inhibition in function of the different basidiocarp maturation phases for the Agaricus brasiliensis strain were observed. The in vivo basidiocarp antineoplasic average activity was 89.22 percent.

Isolation and mycelial growth of Diehliomyces microsporus: effect of culture medium and incubation temperature

The false truffle is one of the main problems in the production of the Agaricus brasiliensis in Brazil and the control of this fungal competitor has been rather difficult due to difficulties in the isolation and cultivation of this pathogen. This experiment was conducted in three stages, the first consisting of the isolation of Diehliomyces microsporus starting from portions of the fruiting body and through the ascospores suspension; second, D. microsporus cultivated in vitro at 15, 20, 25, 30 and 35°C in six different culture media (CSDA, OCDA, PCDA, ODA, PDA, CDA); third, D. microsporus was inoculated on sterilized compost for formation of the fruiting body. The colony formation from tissue of D. microsporus starting from portions of fruiting body was more efficient than germination of the ascospores. Compost medium (CDA) allowed a larger diameter of the D. microsporus colony, followed by the medium made up of compost and potato mixture, favoring a denser composition. The largest mycelial growth speed of D. microsporus occurred when the culture was incubated at 28 and 30°C. Incubation temperatures lower than 15°C or above 35°C inhibited the mycelial growth of D. microsporus completely. The fruiting bodies were obtained easily in sterilized compost and later inoculated along with mycelial competitor.

A falsa trufa está sendo um dos principais problemas na produção do Agaricus brasiliensis cultivado no Brasil e o controle deste fungo competidor tem sido difícil, devido às dificuldades encontradas no isolamento e cultivo do patógeno. Este experimento foi conduzido em três etapas, sendo a primeira constituída pelo isolamento de Diehliomyces microsporus a partir de porções do ascostroma e através da suspensão de ascósporos; a segunda, o cultivo in vitro de D. microsporus nas temperaturas de 15, 20, 25, 30 e 35°C e em seis meios de cultura (CTDA, ACDA, BCDA, ADA, BDA e CDA) e a terceira pela inoculação de D. microsporus no composto (pasteurizado, composto esterilizado e composto esterilizado com camada de cobertura) para formação dos ascostromas. O isolamento de D. microsporus a partir de fragmentos do ascostroma recém coletado foi mais eficiente do que a germinação dos ascósporos; o meio de cultura à base de composto (CDA) proporcionou maior diâmetro da colônia de D. microsporus, seguido pelo meio constituído da mistura de composto e batata, favorecendo um micélio mais denso; a maior velocidade de crescimento de D. microsporus ocorreu quando a cultura foi incubada entre 28 e 30°C; temperaturas de incubação menor que15°C ou a acima de 35°C inibiu completamente o crescimento micelial de D. microsporus; a obtenção de frutificação de D. microsporus foi facilmente obtida em composto esterilizado e posteriormente inoculado com o competidor.

Digital monitoring of mycelium growth kinetics and vigor of shiitake ( Lentinula edodes ( Berk. ) Pegler ) on agar medium

Avaliou-se o crescimento e vigor das linhagens LE 96/17, LE 98/51, LE 98/53 e LE 98/56 de Lentinula edodes (Berk) Pegler em diferentes composições de meio de cultura. As linhagens foram provenientes da Micoteca do Módulo de Cogumelos da Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp, Campus de Botucatu. Os isolados foram obtidos por propagação vegetativa, pela transferência asséptica do micélio para o meio de cultura de extrato de serragem-dextrose-ágar. O crescimento e vigor do micélio foi fotografado diariamente com uma câmera digital, durante a incubação, até a colonização total da placa de Petri. As imagens foram analisadas pelo programa UTHSCSA ImageTool (freeware), versão 2.0, desenvolvido pela University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas. O modelo estatístico que melhor explicou a cinética de crescimento miceliano em área (mm2), das linhagens de cogumelos L. edodes, tem como componente determinístico a exponencial de uma função Gompertz. O vigor, avaliado através da cor do micélio (em escala de tons do cinza), revelou um comportamento similar entre as linhagens, com valor máximo entre o 4º e 5º dia e, em seguida apresentou declínio. Em meios de cultura mais enriquecidos, a velocidade de crescimento das linhagens de L. edodes foi menor e o vigor maior. O monitoramento digital permite uma avaliação objetiva do crescimento e vigor do L. edodes in vitro.

Genotoxic and antigenotoxic effects of organic extracts of mushroom Agaricus blazei Murrill on V79 cells

Agaricus blazei Murrill, popularly known as the sun mushroom, is a native mushroom in SP, Brazil, that has been widely used in the treatment of cancer and many other pathologies in different parts of the world. A water-soluble protein-polysaccharide complex (1 -> 6)beta-D-glucan has been isolated from its fruiting body that showed immune-modulation activity. From organic extracts, linoleic acid has been isolated and determined to be the main substance with antimutagenic activity. Using both the micronucleus (MN) and comet (single cell microgel electrophoresis) assays, this study determined the genotoxic and antigenotoxic potential of A. blazei (AB) obtained from commercial sources or the following strains: a) strains AB 97/29 (young and sporulated phases); b) a mixture taken from AB 96/07, AB 96/09 and AB 97/11 strains; and c) commercial mushrooms from Londrina, PR and Piedade, SP, designated as AB PR and AB SP, respectively. The extracts from these mushrooms were isolated in chloroform:methanol (3:1) and used in vitro at three different concentrations. V79 cells (Chinese hamster lung cells) were exposed to the extracts under pre-, simultaneous and post-treatment conditions, combined with methyl methanesulfonate (MMS). Under the circumstances of this study, these organic extracts did not show any genotoxic or mutagenic effects, but did protect cells against the induction of micronuclei by MMS.

Genetic characterization of isolates of the Basidiomycete Agaricus Blazei by rapd

The genetic divergence of five isolates of Agaricus blazei was determined based on RAPD data. Results indicate that there is little genetic variability among the commercialized strains and that RAPD is a feasible and low cost technique that can be used to characterize this fungus.

Methane biogenesis at low pH and null alkalinity conditions: I. Perspectives of a new operational concept in the anaerobic treatment of industrial wastewaters

Propöe-se novo conceito operacional para tratamento anaeróbio de efluentes industriais com vistas ta metanogênese, sob condiçöes de pH ácido, elevada acidez volátil e alcalinidade total nula. Fundamenta-se na elevada capacidade de adaptaçäo dos microrganismos ao ambiente e visa diminuir custos de operaçäo e controle bem como, minimizar as consequências de desequilíbrio entre a acidogênese e metanogênese. Utilizou-se reatores de laboratórios ligados em série, alimentados em fluxo contínuo ascendente, com temperatura controlada e reciclagem de lodo. O substrato foi água residuária da indústria de chapas de fibras da madeira com correçäo da relaçäo DQO:N:P à razäo de 40:0:0,2, e adiçäo de CaCO3 à base de 100mg/. Ressalte-se que näo foi adotado nenhum outro tipo de controle para balancear a relaçäo acidez volátil/alcalinidade total. Duas fontes de inóculo foram testadas: uma oriunda de digestor operado com lodo de esgoto urbano e outra, de digestor operado em fase ácida, com água servida. Os resultados obtidos ao longo de 201 dias de operaçäo do protótipo de laboratório confirmaram a hipótese central do trabalho, para ambas as fontes de inóculo. Entretanto, tendo em vista que o teor de metano no biogás raramente superou 50% (em média 20 a 25%), o novo conceito deverá ser submetido a estudos de otimizaçäo visando alcançar rendimento similar à metanogênese em pH neutro convencional