Reactividad de sueros de ratones inmunizados con vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella entérica / Reactivity of sera from mice immunized with outer membrane vesicles derived from Salmonella enterica

La fiebre tifoidea causada por Salmonella Paratyphi A (fiebre paratifoidea) es indistinguible de la producida por Salmonella Typhi y el grado de incidencia ha aumentado en los últimos años, especialmente en el sudeste asiático. Por otro lado, la diarrea y otras complicaciones entéricas causadas por Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium continúan siendo un problema de salud grave, especialmente en países subdesarrollados. Las vacunas continúan siendo la forma más efectiva de prevenir estas enfermedades. Existen vacunas basadas en el polisacárido capsular de Salmonella Typhi que protegen contra la fiebre tifoidea; sin embargo, no hay vacunas efectivas licenciadas para uso en humanos que prevengan las enfermedades producidas por los serotipos de Salmonella no tifoideas. El desarrollo de una formulación con capacidad para proteger contra estas enfermedades sigue siendo un desafío para la comunidad científica. En este trabajo se evaluó, mediante Western blot, la reactividad de los sueros de ratones inmunizados por vía subcutánea con formulaciones basadas en vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, contra los respectivos lisados celulares, para identificar la formulación que induce la mejor respuesta inmunológica cruzada. Los resultados obtenidos indicaron una alta reactividad de todos los sueros a los lisados, sin una diferencia aparente entre ellos. Sin lugar a dudas, se deberán realizar pruebas de inmunogenicidad seguidas de pruebas de retos cruzados para identificar un candidato vacunal. Estos resultados sugieren que las vesículas de membrana externa empleadas en este estudio están compuestas por antígenos posiblemente conservados en los tres serotipos de Salmonella y que pueden inducir una respuesta inmune de amplio espectro y protección cruzada(AU)

Typhoid fever caused by Salmonella Paratyphi A (paratyphoid fever) is indistinguishable from that caused by Salmonella Typhi and the degree of incidence has increased in recent years, especially in Southeast Asia. On the other hand, diarrhea and other enteric complications caused by Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium continue to be a serious health problem, especially in underdeveloped countries. Vaccines continue to be the most effective way to prevent these diseases. There are vaccines based on Salmonella Typhi capsular polysaccharide, which protects against typhoid fever; however, there are no effective vaccines licensed for use in humans to prevent disease caused by nontyphoidal Salmonella serotypes. Developing a formulation capable of protecting against these diseases remains a challenge for the scientific community. In this work, the reactivity of the sera of mice immunized subcutaneously with formulations based on Outer Membrane Vesicles (OMV) derived from Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium, was evaluated by Western blot, against the respective cell lysates to identify the formulation that induces the best cross immune response. The results obtained indicated a high reactivity of all the sera to the lysates; without an apparent difference between them. Undoubtedly, immunogenicity tests followed by cross-challenge tests should be performed to identify a vaccine candidate. These results suggest that the OMV used in this study are composed of possibly conserved antigens in the three Salmonella serotypes and that they can induce a broad-spectrum immune response and cross protection(AU)

Condiciones de adsorción de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa derivada de Salmonella Paratyphi A en adyuvantes de aluminio / Adsorption conditions of a vacunal candidate based on outer membrane vesicles of Salmonella Paratyphi A in aluminum adjuvants

La capacidad inmunoestimuladora de la mayoría de las vacunas es potenciada mediante la adsorción en adyuvantes que contienen aluminio. Variando las condiciones de adsorción (pH, tiempo de adsorción) cambia la cantidad de antígeno adsorbida y por lo tanto la capacidad de estimulación del sistema inmune. El Instituto Finlay de Vacunas investiga un nuevo candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A (VME-SPA). El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones de adsorción de las VME-SPA en dos adyuvantes de sales de aluminio (Al(OH)3 y AlPO4). Para ello, las VME-SPA fueron adsorbidas en ambos adyuvantes bajo diferentes condiciones de pH y tiempo. Mediante la construcción de una Isoterma de Langmuir se determinaron parámetros como la capacidad adsortiva (qm) y el coeficiente de adsorción (Kd). El lote de VME-SPA empleado estaba formado por poblaciones de nanoestructuras con un tamaño de partículas entre 60 y 100 nm. La adsorción de las VME-SPA en ambos adyuvantes, mostró valores ≥95 por ciento a pH neutro (6,5-7,0). Las VME-SPA en presencia de AlPO4 alcanzaron el estado de equilibrio en menor tiempo (99 por ciento a partir de 30 min) en comparación con Al(OH)3 (95 por ciento a partir de 3 h). Las isotermas evaluadas para ambos adyuvantes cumplieron con el modelo de Langmuir (R2≥0,99), con valores de qm y Kd diferentes entre los sistemas de adsorción. El estudio demostró que las VME-SPA se adsorbieron satisfactoriamente en ambos geles, proceso en el que están involucrados diferentes mecanismos de adsorción(AU)

The immunostimulation capacity of most vaccines is enhanced through antigen adsorption on aluminum adjuvants. The changes in adsorption conditions (pH, adsorption time), could change the amount of antigen adsorbed and therefore the ability to stimulate the immune system. The Finlay Institute of Vaccine researches a new vaccine candidate based on outer membrane vesicle from Salmonella Paratyphi A (OMV-SPA). The study aim was to determine adsorption condition of OMV-SPA with two aluminium adjuvants (Al(OH)3 and AlPO4). OMV-SPA was adsorbed in both adjuvants under differences conditions of pH and time. Parameters as adsorptive capacity (qm) and adsorption coefficient (Kd) were determined by construction of Langmuir Isotherm. The lot of OMV-SPA used is composed by population of nanostructure with a particle size between 60 and 100 nm. Adsorption of OMV-SPA in both adjuvants showed values ≥95 percent in neutral pH (6.5-7.0). OMV-SPA with AlPO4 got equilibrium state in less time (99 percent from 30 min) compared with Al(OH)3 (95 percent from 3 h). Isotherms from both adjuvants described Langmuir model (R2≥0.99), with qm and Kd values very different between adsorption systems. As conclusion, the study showed that OMV-SPA was adsorbed satisfactorily in both aluminium adjuvants, process in which are involved different adsorption mechanism(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Antigenicidad e inmunogenicidad de una cepa inactivada de Vibrio cholerae O1 El Tor Inaba / Antigenicity and immunogenicity of inactivated Vibrio cholerae 01 El Tor Inaba

INTRODUCCIÓN: el cólera continúa siendo problema de salud, principalmente en las zonas más pobres. La mayoría de los aislamientos que se realizan al nivel mundial pertenecen a Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa, aunque se han reportado brotes causados por el serotipo Inaba, por lo que se aconseja que una vacuna efectiva contra la enfermedad deberá contener células o antígenos de ambos serotipos. OBJETIVO: describir las características de la cepa de V. cholerae O1 El Tor Inaba C6706 como posible cepa para la obtención de vacunas inactivadas contra el cólera. MÉTODOS: se elaboró un lote de siembra de trabajo crioconservado a - 70 ºC, se evaluó su identidad, pureza y viabilidad. La cepa fue cultivada en caldo triptona soya y su inactivación se realizó a 56 ºC durante 20 min. Se evaluó la capacidad antigénica del producto obtenido mediante western blot y ELISA de inhibición de lipopolisacárido. La inmunogenicidad en conejos, inoculados por vía intraduodenal, se determinó mediante la cinética de anticuerpos vibriocidas. RESULTADOS: el lote de siembra de trabajo mantuvo su identidad, pureza y viabilidad durante 18 meses de estudio. Se observó la presencia de los antígenos lipopolisacárido, hemaglutinina sensible a manosa y proteína de membrana externa U, en las suspensiones de células inactivadas de V. cholerae O1, no así de las subunidades A y B de la toxina colérica (CTA y CTB, respectivamente) o pilli corregulado con la toxina (TCP). Por otra parte, se obtuvieron títulos vibriocidas en los sueros de conejos, similares a la respuesta inducida por la cepa viva atenuada 638 de V. cholerae O1, candidata a vacuna oral. CONCLUSIONES: la cepa de V. cholerae O1 El Tor Inaba C6706 mostró características culturales, antigénicas e inmunogénicas que permiten considerarla como posible cepa para la obtención de vacunas inactivadas contra el cólera.

INTRODUCTION: cholera continues being a serius health problem, mainly in the poorest areas. Most of the isolations worldwide belong to Vibrio cholerae O1 biotype El Tor serotype Ogawa, although there have been reported outbreaks caused by serotype Inaba, that is why it is recommended that an effective vaccine against the illness should contain cells or antigens of both serotypes. OBJECTIVE: to describe the characteristics of the strain C6706 of V. cholerae O1 El Tor Inaba as a likely strain for the obtaining of inactivated vaccines for cholera. METHODS: a criopreserved working culture batch was made up at - 70 ºC to evaluate identity, purity and viability. The strain was cultured in tryptone soy broth and was inactivated at 56º C for 20 minutes. Antigenicity of this preparation was tested by Western Blot and ELISA inhibition test. Immunogenicity in adult rabbits, inoculated intraduodenally, was determined by means of kinetics of vibriocidal antibodies. RESULTS: the working culture batch kept their identity, purity and viability during 18 months of study. The results confirmed the presence of relevant antigens as lipopolysaccharide (LPS), mannose-sensitive hemagglutinin (MSHA) and outer membrane protein U (OmpU) in the suspension of inactivated V. cholerae O1 cells, but not cholera toxin subunits (CTA, CTB) or toxin-coregulated pili (TCP).On the other hand, vibriocidal titers were found in rabbit sera, which were similar to those previously reported for the live V. cholerae O1 strain 638, an attenuated oral vaccinal candidate CONCLUSIONS: the V. cholerae O1 El Tor Inaba C6706 strain showed cultural, antigenic and immunogenic characteristics that allow us to consider it as a possible strain for the obtaining of inactivated vaccines for cholera.