Manifestaciones oculares de la toxocariasis en escolares del estado Anzoátegui en Venezuela / Ocular manifestations of toxocariasis in schoolchildren from the state from the Anzoátegui state in Venezuela

RESUMEN El objetivo de este estudio fue determinar manifestaciones oculares de la toxocariasis en escolares. Se realizó un estudio en dos escuelas del estado Anzoátegui en Venezuela en el 2019. Se empleó la prueba de ELISA para determinar los anticuerpos IgG contra Toxocara spp. Las familias completaron un cuestionario y los niños fueron evaluados clínicamente por pediatras y oftalmólogos. Participaron 118 niños, el 18,6% presentó anticuerpos anti-Toxocara spp. Las manifestaciones clínicas con asociación estadísticamente significativa fueron las reacciones alérgicas, epífora y disminución de la agudeza visual. En la evaluación oftalmológica se encontró queratitis, uveítis, iritis, granuloma retiniano, endoftalmitis, amaurosis, leucocoria, desprendimiento de retina y endotropía. Los hallazgos muestran una alta frecuencia de enfermedad ocular en niños con toxocariasis de un estado de Venezuela.

ABSTRACT The objective of this study was to determine ocular manifestations of toxocariasis in schoolchildren. A study was conducted in two schools in the Anzoátegui state in Venezuela in 2019. The ELISA test was used to determine IgG antibodies against Toxocara spp. The families completed a questionnaire, and the children were clinically evaluated by pediatricians and ophthalmologists. 118 children participated, 18.6% presented anti-Toxocara spp. The clinical manifestations with a statistically significant association were allergic reactions, epiphora, and decreased visual acuity. The ophthalmological evaluation found keratitis, uveitis, iritis, retinal granuloma, endophthalmitis, amaurosis, leukocoria, retinal detachment and endotropia. The findings show a high frequency of eye disease in children with toxocariasis from a state of Venezuela.

Infección natural por Trypanosoma cruzi en triatominos que habitan en la palma corozo ( Acrocomia aculeta ) en regiones del oriente de Venezuela / Triatominae in Palm Trees and Their Natural Infection by Trypanosoma cruzi in Regions of Eastern Venezuela

RESUMEN Objetivos Conocer la infestación natural por triatominos y su infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Acrocomia aculeata (A. aculeata) o palma corozo en el estado Anzoátegui, Venezuela. Materiales y métodos Se estudió la infestación triatomínica y su infección por T. cruzi en A. aculeata desafectadas en campañas fitosanitarias. La presencia del parásito se determinó por microscopia y PCR-kDNA, y se realizó su caracterización mediante marcadores moleculares. Resultados Se encontraron 14 palmeras con infestación triatomínica, el 48,8 % de los ejemplares correspondieron a Rhodnius prolixus y el 48,2 % a Triatoma maculata, con desarrollo ontogénico hacia el adulto. Las pruebas parasitológicas y moleculares, su morfología típica y la infección en el modelo murino revelaron la presencia de T. cruzi en 54,8 % en promedio, para ambas especies de triatominos, con circulación del genotipo TcI de T. cruzi. Conclusiónes Se reportó para el estado Anzoátegui en Venezuela, la infestación de palma corozo con Rhodnius prolixus y Triatoma maculata y la presencia de subpoblaciones TcI de T. cruzi, siendo esta palma el hábitat peridomiciliar del binomio triatominos-T. cruzi y posible bioindicador de riesgo de infección para poblaciones humanas circunvecinas.

ABSTRACT Introduction To know the natural infestation by triatominae and their infection by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in Acrocomia Aculeata (A. aculeata) or coyol palm in the state of Anzoátegui, Venezuela. Materials and Methods Triatominic infestation and its infection by T. cruzi was studied in non-affected A. aculeata in phytosanitary campaigns. The presence of the parasite was determined by microscopy and PCR-kDNA, and its characterization was made by means of molecular markers. Results Fourteen palm trees with triatominic infestation were found; 48.8% of the individuals corresponded to Rhodnius prolixus and 48.2% to Maculata Triatoma, with ontogenetic development towards adult. The parasitology and molecular tests, their typical morphology and the infection in the murine model revealed the presence of T. cruzi in an average of 54,8%, for both species of triatominae, with circulation of the TcI genotype of T. cruzi. Conclusions The infestation of coyol palm trees with Rhodnius prolixus and Maculata Triatoma was reported for the state of Anzoátegui in Venezuela, as well as the presence of TcI sub-populations of T. cruzi, being this palm tree the peridomicilar habitat of the triatominae-T. cruzi binomial and possible bioindicador of risk of infection for surrounding human populations.

Molecular typing reveals the co-existence of two transmission cycles of American cutaneous leishmaniasis in the Andean Region of Venezuela with Lutzomyia migonei as the vector

BACKGROUND The transmission routes for American cutaneous leishmaniasis (ACL) are in flux, so studies examining its transmission in humans, mammalian hosts, and sand fly vectors are urgently needed. OBJECTIVES The aim of this work was understand the epidemiological cycles of Leishmania spp., which causes ACL in the Andean Region of Venezuela, by identifying the Leishmania and the sand fly species involved in human and dog infections. METHODS Thirty-one biopsies from patients in Mérida and Táchira states with suspected ACL were studied by both parasitological tests (cultures and hamster inoculation) and a molecular test [Internal transcribed spacer 1 (ITS1) nested polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)]. We also conducted a survey to detect Leishmania infection in dogs (Immunifluorescence antibody test and ITS1 nested PCR-RFLP) and sand flies (ITS1 nested PCR-RFLP) from El Carrizal, a highly endemic focus of ACL in Venezuela. FINDINGS Three different Leishmania species were identified in the clinical samples from humans (Leishmania braziliensis, L. guyanensis, and L. mexicana) and dogs (L. guyanensis and L. mexicana). The predominant sand fly species found were those from the Verrucarum group (infected with L. mexicana) and Lutzomyia migonei (infected with L. guyanensis and L. mexicana). MAIN CONCLUSIONS We show that Lu. migonei may be the putative vector in two ACL epidemiological cycles, involving L. guyanensis and L. mexicana. We also report for the first time the presence of L. guyanensis in domestic animals.

Seroprevalencia y factores de riesgo de cisticercosis en dos comunidades rurales del norte del estado Anzoátegui, Venezuela / Seroprevalence and risk factors of cysticercosis in two rural communities in Anzoátegui state, Venezuela

Resumen Introducción. La cisticercosis es causada por las larvas de Taenia solium, las cuales se localizan principalmente en el sistema nervioso central y causan neurocisticercosis. En Venezuela se han hecho pocos estudios epidemiológicos de esta enfermedad. Objetivo. Determinar la seroprevalencia y los factores de riesgo de la cisticercosis en dos comunidades rurales del estado Anzoátegui, Venezuela. Materiales y métodos. Se hizo una encuesta para recolectar datos sobre los posibles factores de riesgo y los signos y síntomas de la enfermedad, y se tomaron 182 muestras de los habitantes de las comunidades de Boquerón y Punto Lindo. Se determinaron los anticuerpos IgG contra cisticercos de T. solium mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Resultados. En Boquerón, se presentó una seroprevalencia de 3,3 %; debido al bajo número de muestras positivas no se pudo hacer el análisis estadístico. Sin embargo, las tres personas positivas tenían conocimiento de la enfermedad, antecedentes de tenencia de cerdos no confinados, consumo de carne de cerdo semicruda y cefalea frecuente. En Punto Lindo, la seroprevalencia fue de 28,9 %. No hubo diferencias estadísticamente significativas en cuanto al sexo y la edad, sin embargo, se encontró mayor frecuencia en menores de 20 años. Con respecto a los factores de riesgo y los signos y síntomas, se encontró asociación significativa con el consumo de carne de cerdo semicruda (odds ratio, OR=18; IC95% 5,78-55,9), cefalea frecuente (OR=3,6; IC95% 1,15-11,4), convulsiones (OR=18,9; IC95% 2,15-166,5) y problemas de visión (OR=5,7; IC95% 2,13-15,34). Conclusión. Los resultados demostraron que había poca transmisión de cisticercosis en Boquerón, pero mucha en Punto Lindo, sobre todo en niños, lo cual sugeriría que se trata de transmisión reciente.

Abstract Introduction: Cysticercosis is caused by Taenia solium cysticerci, which are located mainly in the central nervous system causing neurocysticercosis. In Venezuela, few epidemiological studies on this disease have been conducted. Objective: To determine the seroprevalence and risk factors for cysticercosis in two rural communities in Anzoátegui state. Material and methods: We conducted a survey to collect data on possible risk factors and signs and symptoms of the disease, and we took 182 samples in two communities, Boquerón and Punto Lindo. Detection of IgG antibodies against T. solium cysticerci was performed by ELISA. Results: Seroprevalence in Boquerón was 3.3%; due to the low number of seropositives the statistical analysis was not possible. However, the three seropositive persons had knowledge of the disease, and a history of consumption of undercooked pork meat, and presence of headache. In Punto Lindo, seroprevalence was 28.9%. There were no significant differences by sex or age; however, we found more seropositives among individuals younger than 20 years. With regard to risk factors and signs and symptoms, significant associations were found with consumption of undercooked pork (OR=18; 95% CI: 5.78 to 55.9), headaches (OR=3.6; 95% CI: 1.15 to 11.4), seizures (OR=18.9; 95% CI: 2.15 to 166.5) and visual problems (OR=5.7; 95% CI: 2.13 to 15.34). Conclusions: The results showed low transmission of cysticercosis in Boquerón, and high in Punto Lindo, where the high prevalence in children suggests recent transmission.

Molecular diagnosis of dengue virus infections in samples collected on filter paper / Diagnóstico molecular de infecciones por virus Dengue en muestras colectadas en papel de filtro

Dengue virus infections (DENV) are a severe public health problem due to the high rates of morbidity and mortality involved, and the fact that no clinical treatment or vaccines are available. In order to strengthen the laboratory diagnosis for surveillance systems in tropical countries with low resources, we report an optimized method using filter paper for blood spotting and subsequent molecular diagnosis of DENV serotypes. Control strains of all serotypes, as well as 35 whole blood patient samples dispensed on filter paper, were stored at room temperature for as long as 36 months. RT-PCR of 5’UTR-C fragment was amplified through adapted protocols to diagnose all dengue serotypes. Results showed amplification for all four viral serotypes, including control viral strains and 88.6 % of the samples. These results allowed determining the utility of filter paper for the preservation of samples regularly obtained from patients with clinical suspicion of dengue in settings where low resources do not permit an immediate analysis of the samples. Likewise, this study evidence the possibility of molecular diagnosis of DENV from multiple areas of the world where there are no laboratories with the capacity to confirm DENV cases.

Las infecciones por virus Dengue (DENV) representan un grave problema de salud pública debido a las altas tasas de morbilidad y mortalidad que causan, además no cuentan con tratamiento clínico específico, ni vacuna. Con el fin de reforzar el diagnóstico de laboratorio para los sistemas de vigilancia epidemiológica en países tropicales con recursos económicos limitados, se optimizó una metodología utilizando papel de filtro para la recolección de muestras y el subsiguiente diagnóstico molecular de los serotipos de DENV. Se emplearon cepas controles correspondientes a todos los serotipos virales, así como 35 muestras de sangre total dispensadas en papel de filtro que fueron mantenidas a temperatura ambiente por 36 meses. Las muestras fueron analizadas mediante RT-PCR para la amplificación de la región del genoma correspondiente a 5´UTR-C de los DENV. Los resultados mostraron la amplificación de los mencionados fragmentos en 88,6% de las muestras analizadas, así como de las cepas controles. Estos resultados evidenciaron la utilidad del papel de filtro para conservación de muestras obtenidas de pacientes con sospecha clínica de dengue ubicados en zonas donde no es posible realizar análisis de laboratorio de forma inmediata, así como su uso para el diagnóstico molecular. De este modo se reforzaría la vigilancia en áreas, donde no hay laboratorios con capacidad para confirmar casos de DENV.

Clonación de secuencias de alfavirus y flavivirus para su uso como controles positivos en el diagnóstico molecular / Cloning alphavirus and flavivirus sequences for use as positive controls in molecular diagnostics

RESUMEN El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

ABSTRACT The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

Análisis de secuencias de moléculas de Taenia solium procesadas post-transcripcionalmente mediante trans splicing / Sequences analysis of molecules of Taenia solium post-transcriptionally processed by trans-splicing

La neurocisticercosis es una enfermedad neurológica causada por la presencia de cisticercos de Taenia solium en el sistema nervioso central. La clonación de genes del parásito es importante para la identificación y estudio de moléculas claves en la biología del parásito, en diagnóstico, protección y en las relaciones parásito-hospedador. En T. solium, ocurre un mecanismo alternativo en el procesamiento de algunos ARNm, denominado trans-splicing, en el cual una pequeña molécula de ARN (Spliced Leader, SL) es añadida al extremo 5´ de una molécula de pre-ARNm, formando diferentes ARNm maduros que contienen un extremo 5´ común. El objetivo de este trabajó fue realizar el análisis de las secuencias de algunas moléculas que utilizan este procesamiento, para conocer mejor este mecanismo en T. solium. Para ello, se realizó un cribado mediante PCR de genotecas de expresión de cisticerco de T. solium utilizando como cebador directo SL y como reverso ZAP-3´UP, oligonucleótido que hibrida con la secuencia del vector. Se obtuvieron diferentes ADN complementarios (ADNc), que fueron clonados en el plásmido pGEM-T-easy, secuenciados y comparados con las bases de datos (GenBank). Un total de 14 moléculas diferentes fueron obtenidas, las cuales muestran similitud principalmente con proteínas de T. solium, Echinococcus sp. e Hymenolepis sp. Se obtuvieron transcriptos completos que codifican una variedad de proteínas que forman parte de la biología propia de organismos vivos, tales como; enzimas, transportadores, proteínas estructurales, entre otras. Aunque no fue posible determinar si existen grupos específicos de ADNc (con funciones comunes), escogidos para llevar a cabo esta modificación post-transcripcional, se pudo observar que el proceso de trans-splicing ocurre en una gran variedad de ARN que codifican diferentes proteínas de importancia biológica para T. solium.

Neurocysticercosis is a neurological disease caused by the presence of Taenia solium cysticerci in the central nervous system. T. solium uses an alternative mechanism for processing some mRNAs, known as trans-splicing, in which a small RNA molecule (Spliced Leader, SL) is added to the 5' end, of one pre-mRNA molecule, leading to the formation of different mature mRNAs that all contain a common 5' end. The aim of this study was to analyze the sequences of some of the molecules that undergo this type of post-transcriptional processing in order to learn more about this mechanism in T. solium. Expression libraries of T. solium cysticerci were screened using PCR with SL as the forward primer and ZAP 3' UP, an oligonucleotide that hybridizes to the vector sequence, as the reverse primer. Different cDNAs were obtained which were cloned in the pGEM-T-easy plasmid, sequenced and then compared with sequences in databases (GenBank). A total of 14 different molecules showing similarities to T. solium, Echinococcus sp. and Hymenolepis sp. proteins were obtained. Complete transcripts encoding a variety of proteins that are part of the biology of living organisms, such as enzymes, transporters and structural proteins, were also identified. Although we could not determine whether specific cDNA groups (with common functions) are selected to carry out this post-transcriptional modification, we were able to observe that the process of trans-splicing occurs in a variety of RNAs that code for several proteins biologically important for T. solium.

Estandarización de la técnica de PCR para la detección de ADN de Leishmanía sp. en muestras de sangre de caninos / Standardization of the PCR technique for detection of Leishmania sp. DNA in canine blood samples

La leishmaniasis es una enfermedad con diversidad clínica y epidemiológica, producida por varias especies de protozoarios parásitos del género Leishmania. Estos parásitos infectan una amplia variedad de hospedadores mamíferos y son transmitidos por insectos del género Lutzomyia, en nuestro país. Los caninos han sido implicados como posibles reservorios del parásito. Para el diagnóstico de leishmaniasis se utilizan técnicas parasitológicas que generalmente tienen baja sensibilidad e inmunológicas, con pobre especificidad. Debido a las limitaciones en el diagnóstico, y lo difícil de la obtención, transporte y almacenamiento de las muestras, en este trabajo se planteó estandarizar de una técnica de PCR anidada (Leishmania nested PCR, Ln-PCR) para la detección de ADN de Leishmania sp. en muestras de sangre de caninos colectadas en papel de filtro. Para ello se titularon las concentraciones de reactivos de la PCR para la amplificación del ADN del parásito y se determinó la sensibilidad analítica y la especificidad de la técnica. Se evaluaron 36 muestras de sangre de caninos (6 infectados y 30 no infectados). Las condiciones óptimas de reacción fueron 0,2 mM de dNTPs, 0,4 µM de cada cebador y 1 U de Taq polimerasa. La sensibilidad analítica de Ln-PCR fue de 10 fg y la especificidad fue de 100% en la detección de ADN de Leishmania sp., ya que no se observó amplificación con ADN de otros parásitos, ni con ADN humano, ni de perro. De las muestras de caninos evaluadas los seis controles infectados todos amplificaron por la PCR, mientras que los 30 no infectados, en ninguno se observó amplificación. La extracción de ADN de muestras de sangre colectadas en papel de filtro fue eficiente para la amplificación por la PCR, técnica que puede ser muy útil para el diagnóstico de leishmaniasis en animales y su implicación como posibles reservorios.

Leishmaniasis is a disease with clinical and epidemiological diversity, caused by several species of protozoan parasites of the genus Leishmania. These parasites infect a wide variety of mammalian hosts, and are transmitted by insects of the genus Lutzomyia in our country. Canines have been implicated as potential reservoirs of the parasite. For the diagnosis of leishmaniasis, parasitological techniques generally with low sensitivity and immunological techniques, with poor specificity, are used. Because of limitations in the diagnosis, and the difficulty to obtain, transport, and store samples, the aim of this research was to standardize a Leishmania nested PCR test (Ln-PCR), for the detection of Leishmania sp. DNA in blood samples from dogs collected in filter paper. For that purpose, concentrations of the PCR reagent for DNA parasite amplification were titrated and the analytical sensitivity and specificity of the technique were determined. A total of 36 canine blood samples (6 infected and 30 uninfected) were evaluated.  The optimal reaction conditions were: 0.2 mM dNTPs; 0.4 µM of each primer; and 1 U of Taq polymerase. The analytical sensitivity of the Ln-PCR was 10 fg and the specificity was 100% in detecting Leishmania sp. DNA, since no amplification was observed with DNA from other parasites, human DNA or canine DNA. The six samples from infected canines evaluated amplified Leishmania sp. DNA by PCR, whereas in none of the 30 samples from uninfected canines the amplification was observed. The DNA extraction from blood samples collected in filter paper was efficient for the PCR amplification, a technique that can be very useful for the diagnosis of leishmaniasis in animals and their involvement as potential reservoirs.

Leishmaniasis.

dogs.

diagnosis.

PCR.

Aproximación a la problemática de la coendemicidad enfermedad de Chagas-Leishmaniasis desde un enfoque de Ecosalud / Approximation to the problem of coendemicity chagas-Leishmaniasis diseases from and Ecohealth approach

Chagas disease and leishmaniasis belong to the group of Neglected Tropical Diseases are zoonosis considered as a public health problem in Venezuela, present in rural, suburban and urban areas. The transmission of both is given by complex processes, which modifies the environment favoring infection with these two groups of protozoa have a common susceptible host, human, many of their geographical foci coincide and can also exist, practices and attitudes linked to ignorance of the modes of transmission of these diseases could encourage contact and infection /coinfection. To study these the Ecohealth approach, which allows to identify interactions between social and ecological systems, which connects to the complex thought, with a view from its fundamental principles proposed: 1) systems thinking, 2) transdisciplinary research 3) social participation, 4) social and environmental sustainability 5) gender equality and social, and 6) the approach of the gap between knowledge and action, which could provide important information of great help to propose public health policies, to strengthen the control programs for these diseases.

La enfermedad de Chagas y leishmaniasis pertenecen al grupo de las Enfermedades Tropicales Desatendidas, son zoonosis consideradas problemas de salud pública en Venezuela, presentes en zonas rurales, suburbanas y urbanas. La transmisión de ambas se da por procesos complejos, en los cuales se modifica el medio ambiente favoreciendo la infección con estos dos grupos de protozoarios, tienen un hospedador susceptible común, el humano, muchos de sus focos geográficos coinciden y pueden existir además, prácticas y actitudes que unidas al desconocimiento de las formas de transmisión de estas enfermedades, pudiesen favorecer el encuentro y la infección/coinfección. Para el estudio de estas se propone el enfoque de Ecosalud, el cual permite identificar interacciones entre los sistemas sociales y ecológicos, que se conecta con el pensamiento complejo, con una mirada desde sus principios fundamentales: 1) pensamiento sistémico, 2) investigación transdisciplinaria 3) participación social, 4) sostenibilidad social y ambiental, 5) equidad de género y social, y 6) el acercamiento de la brecha entre conocimiento y acción, los cuales podrían aportar datos importantes de gran ayuda para proponer políticas públicas de salud, que fortalezcan los programas de control para estas enfermedades.

Comparación de dos protocolos de extracción de ADN de Trypanosoma cruzi cultivados en medio axénico / Comparing two protocols of DNA extraction of Trypanosoma cruzi cultured in axenic medium

Objetivos. Comparar dos protocolos de extracción de ADN de Trypanosoma cruzi para su uso en la amplificación de ADN de minicírculos de kinetoplasto (ADNk) mediante la técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR). Materiales y métodos. Se cultivaron epimastigotas de T. cruzi en condiciones exénicas obteniéndose masas entre 1,5 hasta 100 x 10(6) parásitos. A partir de estas se procedió a la extracción de ADN mediante dos protocolos: extracción con solventes orgánicos (fenol/cloroformo), y empleo de resina (Chelex®100), a partir de los diferentes sedimentos parasitarios. La concentración y pureza del ADN se determinó por espectrofotometría y la integridad se evaluó mediante electroforesis en geles de agarosa. Se realizó el análisis de varianza y comparaciones de medias mediante la prueba de Tukey, utilizando el software Statistix 8.0. Resultados. Se realizaron diez extracciones de ADN de cada una de las diferentes cantidades de parásitos sedimentados. En la extracción de ADN con la resina Chelex®100 se obtuvo mayor rendimiento, pero menor pureza e integridad respecto a la extracción con solventes orgánicos. Sin embargo, permitió la amplificación del producto de 330 pb de ADNk de T. cruzi. Conclusiones. Aun cuando la técnica de Chelex®100 proporcionó menor pureza e integridad del ADN, permitió la amplificación con éxito de ADNk por PCR, evitando el uso de técnicas laboriosas y solventes orgánicos tóxicos.

Objectives. To compare two extraction protocols of Trypanosoma cruzi DNA for use in DNA amplification of kinetoplast minicircles (kDNA) through the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR). Materials and methods. Epimastigotes of T. cruzi were cultured in axenic conditions and masses from 1.5 to 100 x 106 parasites were obtained. DNA extraction was performed using two protocols: extraction with organic solvents (phenol/chloroform), and with resin (Chelex®100), from different parasitic sediments. Concentration and purity of DNA was determined by spectrophotometry, and integrity was assessed by agarose gel electrophoresis. Analysis of variance and comparisons of means were performed through Tukey’s test, using the Statistix 8.0 software. Results. Ten DNA extractions were done of each one of the different amounts of parasitic sediments. In the DNA extraction with Chelex®100 resin, a higher performance was obtained but a lower purity and integrity compared to the extraction with organic solvents. However, it allowed a product amplification of 330 bp of T. cruzi kDNA. Conclusions. Although the technique of Chelex®100 provided less purity and integrity of DNA, it allowed a successful amplification of kDNA by PCR, avoiding the use of laborious techniques and toxic organic solvents.

Estandarización de la técnica de aglutinación directa para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas / Standardization of a direct agglutination test for the immunodiagnosis of Chagas disease

Introducción. La enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypanosoma cruzi y su diagnóstico inmunológico se basa principalmente en la detección de anticuerpos contra T. cruzi mediante pruebas tales como ELISA, inmunofluorescencia indirecta (IFI) y hemaglutinación indirecta (HAI). Esta última tiene el inconveniente de requerir la preparación de eritrocitos de carnero, difíciles de obtener y de poca duración. Sin embargo, existen pruebas alternativas, como la técnica de aglutinación directa. Objetivo. Estandarizar la técnica de aglutinación directa para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Materiales y métodos. Se prepararon parásitos epimastigotes de T. cruzi mediante dos protocolos, con tratamiento con tripsina y sin él. Los parásitos se colorearon, y se determinaron las condiciones óptimas de concentración parasitaria y diluciones de suero. Se utilizaron sueros de pacientes con enfermedad de Chagas, de individuos sanos y con otras parasitosis. Resultados. La concentración parasitaria óptima fue de 500 x10 6 parásitos/ml, utilizando parásitos coloreados y sin tratamiento con tripsina. Las diluciones de suero óptimas fueron de 1/25, 1/50 y1/100, y el punto de corte, la dilución de 1/50. La técnica estandarizada mostró índices diagnósticos de sensibilidad de 94,3 % (IC 95% 79,5-99,0) y de especificidad de 96,3 % (IC 95% 88,8-99,0); se encontró reacción cruzada en tres sueros de individuos con leishmaniasis visceral, con valores pronósticos positivo y negativo de 91,7 % (IC 95% 76,4-97,8) y de 97,5 % (IC 95% 90,4-99,6), respectivamente. Se compararon los resultados con los obtenidos por HAI, ELISA e IFI y la concordancia fue de 96 % con un índice kappa de 0,90 (IC 95% 0,81-0,99). Conclusión. La técnica de aglutinación directa estandarizada podría ser útil para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas.

Introduction: Chagas´ disease is caused by the parasite Trypanosoma cruzi and its immunological diagnosis is mainly based on the detection of antibodies against T. cruzi using tests such as the ELISA, the indirect fluorescence antibody test (IFAT) and the indirect hemagglutination test (IHAT). The main disadvantage of the IHAT is the need to prepare sheep erythrocytes, whose availability is limited and they have a short duration once prepared. However, there are alternative tests, such as the direct agglutination test (DAT). Objective: To standardize the direct agglutination test for the diagnosis of Chagas disease. Materials and methods: Trypanosoma cruzi epimastigotes were prepared using two protocols, with and without trypsin treatment. The parasites were stained and optimal conditions for parasitic concentration and serum dilutions were determined. We evaluated the technique using sera from patients with Chagas disease, from healthy individuals and from individuals with other parasitic diseases. Results: The optimal parasitic concentration was 500 x 10 6 parasites/ml using stained parasites without trypsin treatment. The optimal serum dilutions were 1/25, 1/50 y 1/100 and the cut-off point was the 1/50 dilution. The diagnostic indices for the standardized technique were as follows: Sensitivity, 94.3% (95% CI: 79.5-99.0) and specificity, 96.3% (95% CI: 88.8-99.0), with positive and negative predictive values ?? of 91.7% (95% CI: 76.4-97.8) and 97.5% (95% CI: 90.4-99.6), respectively. Cross-reaction was observed only in three sera from individuals with visceral leishmaniasis. The results were compared with those obtained by IHA, ELISA, and IFA, and the concordance rate was 96% and the kappa index, 0.90 (95% CI: 0.81-0.99). Conclusion: The standardized direct agglutination test could be useful for immunodiagnosis of Chagas disease.

Primer registro de triatóminos naturalmente infectados por Trypanosoma cruzi en el estado Bolívar, Venezuela / First record of naturally infected triatomines with trypanosoma cruzi, Bolivar state, Venezuela

La enfermedad de chagas o tripanosomiasis americana está adquiriendo cada vez mayor importancia en la región amazónica de Venezuela, en la cual hasta ahora se carecía de información de la presencia de trypanosoma cruzi en triatóminos, reservorios y humanos, particularmente para el estado Bolívar, el estado de mayor superficie del país, situado al sur del río Orinoco. Cuatro ejemplares de triatoma maculata fueron recolectados en el peridomicilio de la comunidad de Maniapure, en el municipio Cedeño. En dos de los ejemplares se determinó la infección natural por trypanosoma cruzi al examen al fresco de heces con presencia de tripomastigotos metacíclicos infectantes. Los parásitos fueron inoculados en modelos murinos y aislados en cultivos para su caracterización molecular. Se confirmó el diagnóstico de este parásito por pruebas parasitológicas y moleculares, caracterizándose los aislados como TcI. La importancia de estos hallazgos pioneros podría motivar el estudio de la transmisión vectorial de la enfermedad de chagas en este estado catalogado como no endémico.

American trypanosomiasis or chagas disease is becoming increasingly important in the Amazon region of Venezuela, in which up to now information was lacking of the presence of trypanosoma cruzi in triatomins, reservoirs and humans, particularly for Bolivar state, the state with the largest territory of the country, located in the south of the Orinoco river. Four specimens of triatoma maculata were collected in the peri-domiciliar area of the community of Maniapure, in the Cedeño municipality. Two of these individuals were found naturally infected with trypanosoma cruzi upon examination of fresh stool with presence of metacyclic trypomastigotes. Parasites were inoculated in murine models and isolated for molecular characterization. Parasite isolates were molecularly characterized as TcI. The importance of these pioneering findings should motivate the study of the vector or oral transmission of Chagas disease in this non endemic State of Venezuela.

Epidemiología molecular de los virus Dengue / Molecular epidemiology of Dengue virus

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos a humanos por su alta morbimortalidad y el potencial de diseminación de su vector Aedes aegypti. Además, la falta de una vacuna y medicamentos antivirales específicos, así como el incremento progresivo de las infecciones secundarias y la hiperendemicidad en diferentes países, hacen de esta enfermedad un problema de salud pública. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV), dentro de cada serotipo se han descrito varios genotipos, constituidos a su vez por diferentes linajes o clados. La epidemiología molecular combina los análisis filogenéticos de los DENV detectados en un área geográfica, en un tiempo definido, con la información clínica y epidemiológica disponible. El objetivo de estos estudios es tratar de establecer asociaciones entre genotipos o linajes virales con el origen (ancestros), procedencia geográfica, ruta de transmisión viral, severidad de la enfermedad, grupos poblacionales afectados, y la intensidad y extensión de los brotes epidémicos. La epidemiología molecular ha generado información relevante como la etiología del DENV genotipo Asiático en los casos graves de dengue de la epidemia ocurrida en Venezuela en 1989, y la identificación de cambios nucleotídicos puntuales en el genoma viral asociados a propiedades biológicas fundamentales. En la actualidad se hace necesario realizar análisis exhaustivos del genoma viral completo, conjuntamente con el análisis bioinformático, biológico, clínico y epidemiológico de los cuatro serotipos circulantes en los países endémicos, así como instaurar en los laboratorios adscritos a los sistemas de vigilancia epidemiológica del dengue, la vigilancia molecular para la identificación de genotipos (o linajes) circulantes, lo que contribuiría entre otros aspectos al control efectivo de la enfermedad por DENV.

Dengue is the most important viral disease transmitted by mosquitoes to humans in tropical and subtropical regions of the world. This is the result of its high morbidity and mortality, the spread potential of the vector Aedes aegypti, the lack of effective vaccines and specific antiviral drugs, the gradual increase in secondary infections and hyperendemicity differences in distinct countries. There are four serotypes of dengue virus which are phylogenetically grouped in genotypes and subdivided in lineages or clades. Molecular epidemiology combines phylogenetic analysis of DENV detected in particular geographic areas within a defined time with the available clinical and epidemiologic information. The objective of these studies is to look for relationships between genotypes or lineages, viral origin, geographical spreading and routes of viral transmission, disease severity, population groups affected, and the intensity, speed and extent of outbreaks. Also, molecular epidemiology has generated relevant information such as the Asian genotype DENV etiology in cases of the severe dengue epidemic in Venezuela in 1989, and the identification of specific nucleotide changes in the viral genome associated with its fundamental biological properties. However, analysis of the complete viral genome, together with bioinformatic, biological, clinical and epidemiological analysis corresponding to the four serotypes circulating in endemic countries should be performed. Molecular surveillance for the identification of genotypes (or strains) circulating should be implemented in the laboratories responsible for the epidemiological surveillance of dengue, which would improve the effective control of DENV.

Estandarización de la técnica de ELISA para el diagnóstico inmunológico de toxocariasis humana / Standardization of ELISA technique for the immunological diagnosis of human toxocariasis

La toxocariasis o síndrome de larva migrans visceral es causada por un nemátode del género Toxocara, parásito de animales domésticos (perros y gatos). El hombre es un hospedador accidental, al contaminarse con huevos embrionados del parásito. Las larvas invaden la pared intestinal y son transportadas a vísceras, musculatura o globo ocular, donde son atacadas por una reacción granulomatosa del hospedador. El diagnóstico de la enfermedad es complicado debido a la sintomatología inespecífica y que las larvas solo pueden ser evidenciadas por biopsias, que es un método invasivo. Los métodos inmunológicos son una alternativa, en tal sentido en esta investigación se planteó como objetivo estandarizar una técnica inmunológica para la determinación de anticuerpos anti-T.canis para el diagnóstico de toxocariasis humana. Los parásitos adultos expulsados por cachorros infectados se identificaron por microscopia óptica y electrónica, se obtuvieron los huevos, los cuales se hicieron embrionar para la liberación de las larvas, y éstas se mantuvieron en cultivo, para luego obtener y purificar los antígenos de excreción/secreción. Se estandarizaron las condiciones de reacción de la ELISA, obteniéndose como concentraciones óptimas 2 μg/mL de antígeno, dilución de suero y conjugado fueron de 1/400 y 1/20000 respectivamente. Los índices diagnósticos fueron: sensibilidad 100%, especificidad 98,9%, valor predictivo positivo 94,4% y valor predictivo negativo 100%. Con la técnica estandarizada se pudieron diferenciar los sueros de pacientes con Toxocariasis, con respecto a los de pacientes con otras helmintiasis y muestras de suero de individuos sanos, logrando el diagnóstico de Toxocariasis humana.

The toxocariasis or visceral larva migrans syndrome is caused by a nematode of the genus Toxocara, a parasite of domestic animals (dogs and cats). Man is an accidental host, by oral contamination with embryonated eggs of the parasite. The larvae invade the intestinal wall and are transported to the viscera, muscle or eyeball, where they are attacked by a granulomatous reaction of the host. The diagnosis of the disease is complicated by nonspecific symptoms and the larvae can only be demonstrated by biopsy which is an invasive method. Immunological methods are an alternative. The objective of this study was standardizing an immunological technique for the determination of anti-T. canis antibodies for diagnosis of human Toxocariasis. We identified by optical and electron microscopy, adult worms expelled by infected pups and we obtained eggs, which became embryos that released the larvae. These were maintained in culture. Excretion/secretion antigens (E/S) were purified from the culture. Subsequently, we standardized reaction conditions of the ELISA technique, obtaining as optimal concentrations 2 mg/mL of antigen, serum dilution and conjugate 1/400 and 1/20000 respectively. With the standard technique we evaluated 17 serum samples from patients with confirmed Toxocariasis, 50 patients with other helminth infections and 40 healthy individuals. The diagnostic indexes were sensitivity 100%, specificity 99%, 94% positive predictive value and negative predictive value 100%. The diagnostic indexes obtained show that the ELISA using excretion/secretion antigen of the parasite is suitable for immunodiagnosis of human Toxocariasis.

Panstrongylus rufotuberculatus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) infectado con Trypanosoma cruzi en el estado Anzoátegui (Venezuela) / Panstrongylus rufotuberculatus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) infected with Trypanosoma cruzi in the state of Anzoátegui (Venezuela) Antonio Morocoima

En el caserío rural Mundo Nuevo, municipio Pedro María Freites, estado Anzoátegui (Venezuela) se capturaron en la pared externa de una vivienda cuatro ejemplares adultos de Panstrongylus rufotuberculatus (Champion, 1899) (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae), uno de los cuales mostró infección por Trypanosoma cruzi, evidenciada por examen directo del contenido intestinal. El comportamiento del aislado en ratones NMRI presentó parasitismo tisular en 47% de 12 tejidos estudiados. La especie T. cruzi fue confirmada por PCR-ADNk y PCR ADN satélite. Se demuestra por primera vez la presencia de esta especie silvestre en el estado Anzoátegui.

In the rural village Mundo Nuevo, municipality Pedro Maria Freites, Anzoátegui state (Venezuela), four adults of Panstrongylus rufotuberculatus (Champion, 1899) (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) were captured in the external wall of a human dwelling. One triatomine was infected by Trypanosoma cruzi. The isolate inoculated in NMRI mice showed parasites in 47% of 11 studied tissues. T.cruzi was confirmed by PCR-kDNA and PCR satellite DNA.The presence of this species represents, to our knowledge,the first report for this state.

Clonación de genes por spliced leader a partir de genotecas de expresión de cisticercos de Taenia solium / Spliced leader gene cloning from expression library of Taenia solium cysticerci

La cisticercosis es una enfermedad causada por el estadio larvario (cisticerco) de Taenia solium. El diagnóstico de la enfermedad se ve limitado por la disponibilidad de antígenos del parásito, donde una alternativa sería la clonación de genes codificantes de antígenos. En T. solium, al igual que en otros parásitos, ocurre un mecanismo alternativo en el procesamiento de algunos ARNm, denominado trans-splicing, en el cual una pequeña molécula de ARN conocida como Spliced Leader (SL) es añadida al extremo 5´ de una molécula de pre-ARNm, formando diferentes ARNm maduros que contienen un extremo 5´ común. Debido a las limitaciones que presenta el diagnóstico, además del interés en el estudio de este mecanismo, el objetivo de este trabajo fue clonar moléculas que utilizan este procesamiento posttranscripcional. Para ello, se realizó un cribado mediante PCR a partir de genotecas de expresión de cisticerco de T. solium utilizando como cebador directo TSSL-DW2 y como reverso ZAP-3´UP que hibridan con la secuencia SL y con la del vector, respectivamente. Se obtuvieron productos de ADNc de diferentes tamaños, que fueron clonados en un plásmido de mantenimiento (pGEM-Teasy). Posteriormente, mediante PCR de colonias se verificó la presencia de los insertos y se estimó su tamaño, obteniendo un total de 56 clones de tamaño variable (150-1200 pb). Este diseño permitió la identificación de genes de T. solium que utilizan el mecanismo de trans-splicing; y además de ser una estrategia fácil para clonar moléculas completas, abre camino para futuras investigaciones enfocadas en el diagnóstico de cisticercosis.

Cysticercosis is caused by the larval stage of Taenia solium (cysticercus). The diagnosis of the disease is limited by the availability of parasite antigens; an alternative would be the cloning of gene encoding antigens. In T. solium, as in other parasites, an alternative mechanism in the processing of some mRNAs called trans-splicing occurs, in which a small RNA known as Spliced Leader (SL) is added to the 5´ end of pre-mRNA molecules, forming a common 5´-terminal exon of the mature mRNAs. Due to limitations for diagnosing the disease, in addition to the interest in the study of this mechanism, the aim of this work was to clone molecules that use this posttranscriptional processing. In this study we did a screening by PCR from cDNA library of T. solium cysticerci using the forward primer TSSL-DW2 and the reverse primer ZAP-3´UP that hybridize with SL and vector sequence, respectively. cDNAs of different sizes were obtained that were cloned in maintenance plasmids (pGEM-T-easy). The presence of inserts and their sizes were estimated by colony PCR, obtaining a total of 56 clones of different sizes (500-1200 bp). This design allows the identification of of T. solium genes using the trans-splicing mechanism; and besides being an easy strategy to clone complete molecules, it opens the way for future investigations on the diagnosis of cysticercosis.

Diagnóstico inmunológico de la Enfermedad de Chagas a partir de muestras colectadas en papel de filtro / Immunological diagnosis of Chagas disease from samples collected on filter paper

La Enfermedad de Chagas, es producida por el parásito Trypanosoma cruzi. Los métodos de diagnóstico inmunológico son los más utilizados, pero presentan problemas de reacciones cruzadas con Leishmaniasis y Rangeliosis, por lo cual la Organización Mundial de la Salud (OMS) sugiere la ejecución de tres pruebas inmunológicas diferentes. En Venezuela la disponibilidad de las tres pruebas sólo se encuentra en centros de investigación y en laboratorios de referencia. Debido a esto, las muestras deben ser transportadas bajo estrictas condiciones de conservación y aún así pueden llegar deterioradas. El uso del papel de filtro podría ser una alternativa para la recolección y transporte de las muestras. El objetivo del presente trabajo fue comparar los resultados de las técnicas de ELISA, HAI e IFI utilizando muestras de sangre colectadas en tubo y en papel de filtro. Las muestras se procesaron mediante las técnicas de Inmunoensayo Enzimático (ELISA), Hemaglutinación Indirecta (HAI) e Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Para las muestras de papel se hicieron eluciones de 1/50 a diferentes tiempos para ELISA e IFI, y de 1/25 para HAI. Se obtuvo una sensibilidad de 91% y una especificad de 100% en el diagnóstico de las muestras colectadas en papel de filtro a través de las tres técnicas inmunológicas. Al compararlo con los resultados de las muestras colectadas en tubo se encontró un índice de kappa 0,91 (P<0,001), lo que indica una alta concordancia entre las dos técnicas de recolección de muestras y la confiabilidad de los resultados.

Chagas disease is produced by the parasite Trypanosoma cruzi. Immunological diagnosis methods are the most used, but they present problems of cross reactions with Leishmaniasis and Rangeliosis. For this reason, the World-Health-Organization (WHO) suggests the use of three different immunological tests. In Venezuela, the three tests are only available in research centers and laboratories of reference. Consequently, many samples must be transported under strict conditions of conservation, and despite this, they may become spoiled before arriving at the mentioned centers. The use of the filter paper could be an alternative for the collection and transportation of the samples. The aim of the present work was to compare the results of ELISA, HAI and IFI techniques using blood samples collected in tubes and in filter paper. The samples collected in tubes and filter paper were processed by ELISA, HAI and IFI techniques. For the filter paper samples elutions of 1/50 were done at various times for ELISA and IFI, and of 1/25 for HAI. Was obtained a sensibility of 91 % and specificity of 100 % in the final diagnosis of the samples collected in filter paper using the three techniques before mentioned, finding a kappa index of 0.91 (P <0.001) in both types of samples, indicating a high concordance between the two sample collection techniques and thus the reliability of the results obtained by means of three immunological techniques.

Enfermedad de Chagas en el estado Anzoátegui, Venezuela: Registro de un caso agudo y caracterización parasitológica y molecular del aislado / Chagas disease in Anzoategui state, Venezuela: Detection of an acute case and parasitological and molecular characterization of the parasite isolate

Se describe un caso agudo de enfermedad de Chagas en un preescolar de sexo masculino, de 6 años de edad, procedente del caserío Las Lajas, municipio Sotillo, estado Anzoátegui, Venezuela. Clínicamente, a la inspección y palpación, presentó eritema y edema bipalpebral derecho, con adenomegalia y nódulo satélite que sugiere el clásico signo de Romaña. También, presentaba lesión cutánea plana eritematosa entre el borde externo del recto abdominal izquierdo y la cicatriz umbilical, compatible con chagoma de inoculación. Además, se detectó hepatoesplenomegalia y fiebre de 38 y 39ºC. A la auscultación se escuchó soplo mesosistólico paraesternal. El tratamiento con Clindamicina no fue resolutivo, por lo cual se procedió a investigar la presencia del agente causal en sangre, mediante exámenes directos e indirectos, serología y técnicas moleculares. El estudio parasitológico comprobó la presencia de trypanosoma cruzi, que resultó de moderada virulencia en sangre, en modelos murinos, con amplio espectro de órganos invadidos especialmente células musculares de los tres tipos: esqueléticas cardíacas y lisas. El aislado fue compatible con los referentes moleculares del linaje TcI, el de más amplia distribución en Venezuela. Los resultados indican que hay transmisión activa de la enfermedad de chagas en el estado Anzoátegui, lo cual amerita más investigaciones.

An acute case of Chagas disease in a preschool male, 6 years old, from the village of Las Lajas, municipality of Sotillo, state of Anzoátegui, Venezuela, is described. Clinically on the inspection and palpation, he presented right bipalpebral erythema and oedema with a subsequent satellite node, suggesting the classical Romaña sign. He also had a flat erythematous lesion between the outer edge of the left rectus abdominis and the umbilical scar, compatible with a chagoma of inoculation. Hepatoesplenomegaly was also detected. The patient had fever of 38ºC and 39ºC. On auscultation, parasternal mesosistolic blow was heard. As treatment with Clindamycin was not resolving, we decided to investigate the presence of causal agent in blood, by means of direct and indirect methods, serology and molecular techniques. The parasitological study demonstrated the presence of Trypanosoma cruzi, which showed moderate virulence in blood, murine models, with broad spectrum of colonized organs, especially cardiac, skeletal, smooth muscle cells and atypical invasion of kidneys. The molecular characterization of isolates showed a pattern compatible with TcI lineage, the most distributed in Venezuela. These results indicate that active transmission of Chagas disease in the state of Anzoátegui persists and more investigations are required.

Teniasis/cisticercosis: avances en diagnóstico inmunológico y molecular / Taeniasis/cysticercosis: advances in inmunological and molecular diagnosis

La teniasis es la infección parasitaria producida por el adulto de Taenia solium y T. saginata, mientras que la cisticercosis es causada por el estadío larvario (cisticerco) de estos ténidos enhospedadores intermediarios; el hombre puede de forma accidental adquirir la cisticercosis. El binomio teniasis/cisticercosis causa graves problemas de salud pública y económicos en las zonas endémicas de África, Asia, y Latinoamérica, además de otras áreas como consecuencia de los viajes y las migraciónes. La neurocisticercosis es la enfermedad parasitaria más importante del sistema nervioso central. El diagnóstico de la teniasis se logra generalmente mediante examenes coprológicos, mientras que el diagnóstico de la cisticercosis se lleva a cabo por métodos parasitológicos, por técnicas de imágenes y una amplia variedad de ensayos inmunológicos. Los métodos de diagnóstico inmunológico convencional presentan graves limitaciones, baja sensibilidad y especificidad, no estandarizados convenientemente y basados en la utilización como antígeno del siempre escaso material parasitario. Actualmente se están utilizando nuevas herramientas y técnicas que permiten un mejor diagnóstico de estas enfermedades, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, antígenos recombinantes, péptidos sintéticos, PCR, cuya manipulación es de fácil estandarización e independientes de las fuentes del siempre preciado material parasitario.