ABSTRACT
Realizar una caracterización bioquímica y molecular del principio coagulante del veneno de Bothrops pictus. Materiales y métodos. Se realizó la amplificación del gen a partir de cDNA, se analizó la homología de la secuencia nucleotídica y de la proteína deducida. Se procedió a purificar la enzima para los análisis de secuenciación directa N terminal de los primeros 20 aminoácidos y los ensayos de coagulación sobre plasma humano y fibrinógeno humano, por otro lado, se evaluó el patrón de corte del fibrinógeno por medio de PAGE SDS y la actividad defibrinogenante en roedores albinos (18-22 g). Se determinó el contenido de carbohidratos asociados, el efecto de inhibidores clásicos de proteasas y el efecto de iones bajo la forma de cloruros. Resultados. La enzima mostró homología en la estructura primaria con otras TLEs reportadas para la familia Viperidae, la dosis coagulante mínima (DCM) sobre plasma y fibrinógeno humano fue de 18 y 6 ug respectivamente y su potencia coagulante fue de 131,1 NHI unidades de trombina. La enzima se mostró estable a condiciones fisiológicas y prescinde de iones para su actividad. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25,76%), hexosaminas (13,1%) y ácido siálico (0,76%). Los agentes fluoruro de fenil metil sulfonil floruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) fueron los principales inhibidores de la actividad enzimática en tanto que la heparina no tuvo efecto inhibidor. Conclusiones. El principio coagulante del veneno de Bothrops pictus es una enzima similar a trombina...
To perform a biochemical and molecular characterization of the coagulant principle from Bothrops pictus venom. Materials and methods. We amplified the genetic sequence of this enzyme from cDNA and analyzed the homology of its nucleotide sequence and its deduced protein. This enzyme was also purified for N-terminal sequencing of first 20 amino acids and for coagulation assays using human plasma and human fibrinogen. Furthermore, cleavage pattern on fibrinogen was evaluated using SDS-PAGE and defibrinogenant activity on white mice (18-22 g). Finally, associated carbohydrate content, effect of protease inhibitors and chloride ions on its enzymatic activity were analyzed. Results. The Thrombin-like Enzyme from Bothrops pictus showed homology at primary level of structure with other previously reported TLEs from Viperidae family. Minimum Coagulant Dosis (MCD) on plasma and human fibrinogen were 18 and 6 ug, respectively, and its coagulant potency was 131.1 NHI Thrombin units. This TLE was stable under physiological conditions and chloride ions are not necessary for its activity. Detected associated carbohydrates were hexoses (25.76%), hexosamines (13.12%) and sialic acid (0.76%). Phenyl methyl sulphonyl fluoride (PMSF) and dithiothreitol (DTT) were the main inhibitors of its enzymatic activity, but heparin had no inhibitor effect. Conclusions. The coagulant principle of Bothrops pictus venom is a Thrombin-like enzyme...