Using Pichia pastoris to produce recombinant glycerol kinase / Produção de glycerol quinase recombinante utilizando o sistema Pichia pastoris

The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been developed into an efficient expression system for the production of recombinant protein under the tight control of the methanol-induced alcohol oxidase promoter (pAOX1). In this study, a 2.5-liter culture system was developed for the growth of a P. pastoris strain bearing the GUT1 gene from Saccharomyces cerevisiae for the expression of recombinant glycerol kinase (GK). The best culture conditions to produce high levels of secreted GK were investigated by growing the recombinant strain of P. pastoris in shake flasks and a fermenter. Cell growth and enzyme production were found to be optimal after two days of growth. Enzyme production was affected by the nitrogen source, Difco peptone being the most appropriate for this purpose. Three different rates of air flow (1 to 3 L/min) were tested to observe their effect on cell growth and the secretion of GK into a medium containing 1% methanol as the sole carbon source. Increasing the rate of air bubbling in the culture medium enhanced both cell growth and GK activity, reaching a dry biomass of 7.84 mg/mL, cell viability of 98.4% and a maximal GK activity of 1.57 U/mL, at a flow rate of 2.0 L/minute, at 30° C and pH 6.0. Moreover, the enzyme activity in the P. pastoris culture medium was 2.3 times higher under these conditions than in the shake-flask culture, demonstrating the significant influence of aeration on biomass production and GK activity secreted by P. pastoris...

A levedura metilotrófica Pichia pastoris possui um sistema de expressão eficiente para a produção de proteínas recombinantes. A indução da produção da proteína de interesse é feita com metanol, que é capaz de ativar a transcrição do gene de interesse clonado sob controle do promotor do gene AOX1. Um meio de cultura de 2.5 litros foi elaborado para o crescimento da cepa Pichia pastoris construída com o gene GUT1 de Saccharomyces cerevisiae para expressar a enzima recombinante glicerol quinase (GK). As condições ideais de cultura, para alcançar altos níveis de expressão de GK foram investigados em crescimentos realizados em frascos e fermentador. Crescimento celular e produção de enzima atingiram valores ótimos em dois dias de cultura. A produção enzimática foi afetada pela fonte de nitrogênio no meio. Peptona da marca Difco foi a fonte de nitrogênio mais adequada para a expressão destaenzima. Três diferentes concentrações (1-3 L / min) defluxo de ar foram analisados em ensaios de crescimento celular e secreção da GK, no meio contendo 1 % demetanol como única fonte de carbono. O aumento do fluxo do ar no meio de cultura produziu melhores resultados para o crescimento celular e atividade da GK, atingindo 7,84 mg / mL de biomassa seca e 98,4%de viabilidade. A máxima atividade de GK foi de 1,57U / mL, com a concentração de fluxo de ar de 2,0 L/ minuto a 30 ° C e pH 6.0. O aumento da atividade enzimática foi 2,3 vezes maior no meio de cultura da Pichia pastoris nestas condições, revelando a influência deste parâmetro na produção de biomassa e atividade da GK...

Aspectos toxicológicos do bissulfito e outros agentes tóxicos sobre a síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase citoplasmática de levedura de panificação / Toxicological effects of bisulfite and other toxic agents on the cytoplasmic glycerol-3-phosphate dehydrogenase of baker's yeast

A síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase intracelular (EC 1.1.1.8) foi investigada a partir de fermento de panificação em cultivos submersos, contendo glicose ou glicerol como únicas fontes de carbono. Agentes inibitórios da via glicolítica, do ciclo de Krebs e da Cadeia Respiratória inibiram a síntese da enzima quando adicionados em baixas concentrações até 7,5 x 10-4 mol/L. A repressão exercida pela glicose sobre a síntese da glicerol-3-fosfato desidrogenase em meio YP glicose foi reduzida, com a adição de produtos de fermentação e de bissulfito de sódio. Observou-se aumentos de 22-110% na síntese da enzima. Entretanto, em meio YP glicerol, a adição de bissulfito de sódio 0,06 % (p/v) reduziu a síntese da enzima em 29%, enquanto, o acetaldeído 0,012 % (v/v) estimulou a síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase em 12%...

Isolamento de fungos produtores de enzimas pectinolíticas / Isolation and characterization of pectinolytic fungi

Amostras de solo foram coletadas no Campus Universitário da UNESP de Araraquara, SP e utilizadas no isolamento e caracterização de fungos com capacidade de sintetizar enzimas pectinolíticas. Estas enzimas vêm despertando crescente interesse na indústria de alimentos. Duzentas e quarenta e seis linhagens foram isoladas em meio PDA e selecionadas, baseadas no formato e tamanho da colônia, morfologia (micélio septado, conídios não septados e negros, cabeça de esporulação em forma de cotonete), após crescimento por 48h a 30ºC. A geração de halo de coloração ao redor das colônias foi acompanhada em meio sólido contendo pectina cítrica 2 por cento (p/V) e avaliada na presença do corante vermelho de rutênio 0,5 por cento. A capacidade de síntese de enzimas pectinolíticas foi avaliada em cultura sólida (índice pectinolítico) e através de fermentação submersa. Vinte e cinco fungos, caracterizados em cultura sólida, forma capazes de sintetizar enzimas pectinolíticas extracelulares em fermentação submersa. A maior atividade pectinolítica (15,0 U/mL) ocorreu no crescimento do isolado CFCF-0492, enquanto o isolado CFCF-CC1 foi o que apresentou o maior acúmulo de biomassa final em cultura submersa. A atividade pectinolítica (medida através do índice paectinolítico) foi melhor preservada quando esporos dos fungos foram mantidos em meio ágar-Czapeck.