Plesiomonas shigelloides exports a lethal cytotoxic-enterotoxin (LCE) by membrane vesicles

ABSTRACT Plesiomonas shigelloides isolated from water in Brazil was previously described as a hemorrhagic heat-labile cytotoxic-enterotoxin producer. We purified this toxin from culture supernatants using ion metallic affinity chromatography (IMAC) followed by molecular exclusion chromatography. The pure toxin presented molecular mass of 50 kDa and isoelectric point (pI) around 6.9 by 2D electrophoresis. When injected intravenously, the purified cytotoxic-enterotoxin induced also severe spasms followed by sudden death of mice. Hence, we entitled it as lethal cytotoxic-enterotoxin (LCE). The presence of membrane vesicles (MVs) on cell surfaces of P. shigelloides was observed by scan electron microscopy (SEM). From these MVs the LCE toxin was extracted and confirmed by biological and serological assays. These data suggest that P. shigelloides also exports this cytotoxic-enterotoxin by membrane vesicles, a different mechanism of delivering extra cellular virulence factors, so far not described in this bacterium.

Molecular characterisation of the NSP4 gene of group A human rotavirus G2P[4] strains circulating in São Paulo, Brazil, from 1994 and 2006 to 2010

Group A human rotaviruses (HuRVA) are causative agents of acute gastroenteritis. Six viral structural proteins (VPs) and six nonstructural proteins (NSPs) are produced in RV-infected cells. NSP4 is a diarrhoea-inducing viral enterotoxin and NSP4 gene analysis revealed at least 15 (E1-E15) genotypes. This study analysed the NSP4 genetic diversity of HuRVA G2P[4] strains collected in the state of São Paulo (SP) from 1994 and 2006-2010 using reverse transcription-polymerase chain reaction, sequencing and phylogenetic analysis. Forty (97.6%) G2P[4] strains displayed genotype E2; one strain (2.4%) displayed genotype E1. These results are consistent with the proposed linkage between VP4/VP7 (G2P[4]) and the NSP4 (E2) genotype of HuRVA. NSP4 phylogenetic analysis showed distinct clusters, with grouping of most strains by their genotype and collection year, and most strains from SP were clustered together with strains from other Brazilian states. A deduced amino acid sequence alignment for E2 showed many variations in the C-terminal region, including the VP4-binding domain. Considering the ability of NSP4 to generate host immunity, monitoring NSP4 variations, along with those in the VP4 or VP7 protein, is important for evaluating the circulation and pathogenesis of RV. Finally, the presence of one G2P[4]E1 strain reinforces the idea that new genotype combinations emerge through reassortment and independent segregation.

Diarrhea outbreak in Pernambuco, Brazil, associated with a heat-stable cytotoxic enterotoxin produced by Aeromonas caviae / O surto de diarreia em Pernambuco, Brasil é associado com uma enterotoxina citotóxica termo-estável produzida por Aeromonas caviae

SUMMARYIn the present study enterotoxic and cytotoxic activities of twenty Aeromonas caviaestrains were examined. They originated from fecal specimens of patients with acute diarrhea during an outbreak in Brazil in 2004. Culture supernatants of fourteen strains (70%) caused fluid accumulation in rabbit ileal intestinal loops and in suckling mice assays, and also showed a cytotoxic activity in Vero and Caco-2 cells. The enterotoxic and cytotoxic factors were heat-stable after culture supernatants treatment at 100 ºC. The results revealed that A. caviaestrains produce a putative diarrheagenic virulence factor, a heat-stable cytotoxic enterotoxin that could be linked to the diarrhea outbreak that took place in Brazil.

RESUMOEm 2004 ocorreu um surto de diarreia aguda no Estado de Pernambuco, Brasil. Setenta por cento (14 dos 20) dos sobrenadantes de cultura de Aeromonas caviae,isoladas neste episódio induziram acúmulo de líquido em testes de alça ligada de intestino de coelhos, assim como em teste em camundongos recém-nascidos. Os mesmos sobrenadantes mostraram também atividade citotóxica em células de Vero e Caco-2, mas não em células HeLa e HEp2. As atividades enterotóxicas e citotóxicas mantiveram-se mesmo após o aquecimento a 100 ºC dos sobrenadantes de cultura. Este trabalho revela a expressão de um provável fator diarreiogênico: uma enterotoxina-citotóxica termo-estável, produzida por A. caviaeque pode ser associada ao surto de diarreia ocorrido no Brasil. Atualmente estamos purificando esta enterotoxina termo-estável, com o objetivo de elucidar seu papel como fator de virulência na diarreia causada por A. caviae.

Comparaçäo do Staphy-test e o teste de coagulase em tubo, na identificaçäo de amostras patogênicas de Estafilococos de origem animal / Comparative evaluation of the Staphy-test and the tube coagulase test for the identification of pathogenic staphylococci from animal sources

Setenta e cinco amostras de Staphylococcus sp. isoladas de bovinos e suínos foram estudadas comparativamente pela prova de coagulase em tubo e pelo Staphy-Test. Na primeira foram usados plasmas de origem humana, bovina e de coelho, considerando-se como reaçäo positiva a produçäo de fibrina em pelo menos um dos plasmas. Onze (14,66%) amostras foram negativas em ambos os testes, sendo considerados como estafilococos näo patogênicos. As demais amostras, num total de 64 (85.33%), sendo 18 de origem bovina e 46 de origem suína, foram enquadradas como estafilococos patogênicos por terem sido positivas na prova de coagulase em tubo e/ou no Staphy-Test. Para a prova de coagulase em tubo foi verificado que a origem do plasma a ser utilizado influi nos resultados obtidos, principalmente em relaçäo às amostras de origem suína, que apresentaram um maior número de resultados falso-positivos quando se usou plasma bovino. Par as amostras bovinas, os plasmas usados tiveram comportamento semelhante, sendo aparentemente superiores os de origem bovina e de coelho. Os resultados da comparaçäo da prova de coagulase em tubo com o Staphy-Test revelaram, para as amostras bovinas e suínas, respectivamente, correlaçöes de positividade a 94,4% e 89,1%. Entre as primeiras, das 18 amostras estudadas, apenas 1 (5,55%) foi negativa no Staphy-Test. Em relaçäo às amostras suínas, 3 (6,53%) foram negativas no Staphy-Test, embora positivas em prova de coagulase em tubo. Duas (4,34%) outras amostras apresentaram resultado inverso. Os dados obtidos na presente pesquisa, quando comparados a outros testes comerciais rápidos para a detecç äo do "clumping factor" permitem recomendar o Staphy-Test para estudos epidemiológicos ou de rotina laboratorial, a identificaçäo rápida de amostras patogênicas de estafilococos de origem bovina e suína

Incidência de rotavírus em suínos na regiäo de Campinas, Säo Paulo

Foi realizado um estudo preliminar na incidência de rotavírus em suínos na regiäo de Campinas, S.P. Noventa e duas amostras de fezes diarréicas foram coletadas durante o período de 1985 a 1986. As técnicas utilizadas para a detecçäo de rotavírus foram a imunoeletromicroscopia (IEM), ensaio imunoenzimático (EIE) e a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Das 92 amostras estudadas, 18 (19,5%) foram positivas para rotavírus, em pelo menos dois dos testes utilizados. O teste de PAGE mostrou-se mais sensível que os outros dois métodos, uma vez que das 18 amostras positivas, 17 (94,4%) apresentaram um perfil eletroforético típico de rotavírus do grupo A. O EIE foi positivo para 14 amostras, sendo que uma delas näo foi detectada em PAGE. Das 54 amostras analisadas em IEM, somente 11 amostras (20,3%) foram positivas, todas elas também diagnosticadas em PAGE e/ou EIE. Sendo assim, podemos concluir que no presente estudo, a técnica de PAGE foi mais sensível que os testes de EIE e IEM para a detecçäo de rotavírus em fezes suínas. A análise do perfil eletroforético das amostras mostrou que as mesmas apresentaram 5 tipos diferentes, sendo que em um deles foi possível a visualizaçäo de uma mistura de rotavírus do grupo A e do grupo C

Fatores de virulência em amostras de Escherichia coli enteropatogênicas para suínos isoladas no Brasil / Virulence factors present in strains of porcine enteropathogenic Escherichia coli isolated in Brazil

Trezentas e vinte e três amostras de Escherichia coli, isoladas de suínos com diarréia em Porto Alegre, RS, pertencentes aos sorogrupos 08, 09, 010, 035, 045, 064, 0108, 0115, 0119, 0138, 0139, 0141, 0147, 0149 e 0157, considerados enteropatogênicos para suínos, foram examinadas quanto à presença de fatores de virulência. A enterotoxina termolábil (LT) foi detectada através do teste de imunohemólise passiva em 56 amostras (17,3%), principalmente nos sorogrupos 08 e 0149, que totalizaram 52 amostras (92.85%) das 56 LT+. Amostras pertencentes aos sorogrupos 035, 0141 e 0157 também produziram LT, ao passo que as amostras pertencentes aos demais sorogrupos näo produziram estA enterotoxina. A enterotoxina termoestável, detectável pelo teste do camundongo recém-nascido, (STa), foi encontrada em 33 (10,2%) amostras pertencentes aos sorogrupos 09, 064, 0138, 0141 e 0149. Entre as 122 amostras STa-, examinadas para a detecçäo de enterotoxina termoestável, pelo teste de alça ligada de leitäo de 6 semanas, (STb), 31 (25,4%) foram positivas e pertenceram aos sorogrupos 035, 064, 0108, 0115, 0119, 0139, 0149 e 0157. Ao que se sabe, é a primeira vez que se relata no Brasil a produçäo de STb por amostras de E. coli de origem suína. Quanto às provas de microhemaglutinaçäo manose-resistente com hemácias de cobaia e cavalo, para a detecçäo dos antígenos K88 e K99, respectivamente, observou-se uma frequência maior de positividade entre as amostras LT+. A presença do antígeno 987P, também relatado pela primeira vez em nosso país, foi detectado sorologicamente em 12 (8,75%) das 137 amostras examinadas