Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identificatio nof the parasite species

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

Desenvolvimento e avaliação comparativa de metodologias baseadas na PCR para o diagnóstico molecular e identificação específica de agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar que circulam em áreas endêmicas brasileiras / Development and benchmarking of methodologies based on PCR for molecular diagnosis and identification of specific etiologic agents of cutaneous leishmaniasis circulating in Brazilian endemic areas

A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido á notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o dianóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quanco cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validade empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espéciesA PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexasm dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, a PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria.