Clostridioides difficile: Characterization of the circulating toxinotypes in an Argentinean public hospital / Clostridioides difficile: caracterización de los toxinotipos circulantes en un hospital público de Argentina

Abstract Clostridioides difficile is a spore-forming anaerobe microorganism associated to nosocomial diarrhea. Its virulence is mainly associated with TcdA and TcdB toxins, encoded by their respective tcdA and tcdB genes. These genes are part of the pathogenicity locus (PaLoc). Our aim was to characterize relevant C. difficile toxinotypes circulating in the hospital setting. The tcdA and tcdB genes were amplified and digested with different restriction enzymes: EcoRI for tcdA; HincII and AccI for tcdB. In addition, the presence of the cdtB (binary toxin) gene, TcdA and TcdB toxins by dot blot and the cytotoxic effect of culture supernatants on Vero cells, were evaluated. Altogether, these studies revealed three different circulating toxinotypes according to Rupnik's classification: 0, I and VIII, being the latter the most prevalent one. Even though more studies are certainly necessary (e.g. sequencing analysis), it is worth noting that the occurrence of toxinotype I could be related to the introduction of bacteria from different geographical origins. The multivariate analysis conducted on the laboratory values of individuals infected with the most prevalent toxinotype (VIII) showed that the isolates associated with fatal outcomes (GCD13, GCD14 and GCD22) are located in regions of the biplots related to altered laboratory values at admission. In other patients, although laboratory values at admission were not correlated, levels of urea, creatinine and white blood cells were positively correlated after the infection was diagnosed. Our study reveals the circulation of different toxinotypes of C. difficile strains in this public hospital. The variety of toxinotypes can arise from pre-existing microorganisms as well as through the introduction of bacteria from other geographical regions. The existence of microorganisms with different pathogenic potential is relevant for the control, follow-up, and treatment of the infections.

Resumen Clostridioides difficile es un anaerobio esporulado que se asocia con episodios de diarreas hospitalarias. Su virulencia se encuentra vinculada, principalmente, a las toxinas TcdA y TcdB, codificadas por sus respectivos genes, tcdA y tcdB, que son parte de un locus de patogenicidad (PaLoc). Nuestro objetivo fue caracterizar los toxinotipos de C. difficile circulantes en un hospital público. Los genes tcdA y tcdB fueron amplificados y digeridos con diferentes enzimas de restricción: EcoRI para tcdA; HincII y AccI para tcdB. Además, se evaluó la presencia de cdtB (gen de la toxina binaria B) y de las toxinas A y B (por dot blot), así como el efecto citotóxico de sobrenadantes de cultivo sobre células Vero. En conjunto, estos estudios revelaron tres toxinotipos circulantes según la clasificación de Rupnik: 0, I y VIII; el más prevalente fue el último. Aunque son necesarios más estudios (ej., secuenciación), es interesante notar que la presencia del toxinotipo I podría estar relacionada con la introducción de bacterias de diferente origen geográfico. En los pacientes infectados con el toxinotipo VIII, el análisis multivariante de los resultados de laboratorio mostró que los aislamientos asociados a decesos (GCD13, GCD14 y GCD22) estaban situados en regiones de los biplots relacionados con valores de laboratorio alterados al momento de la internación. En los otros pacientes, aunque no se observó correlación entre los valores de laboratorio al momento de la internación y la evolución clínica, los niveles de urea, creatinina y recuento de glóbulos blancos estuvieron correlacionados positivamente entre sí una vez diagnosticada la infección. Nuestro estudio revela la circulación de diferentes toxinotipos de C. difficile en un mismo hospital público. La variedad de toxinotipos puede originarse a partir de microorganismos preexistentes en la región, así como también por la introducción de bacterias provenientes de otras regiones geográficas. La existencia de microorganismos con diferente potencial patogénico es relevante para el control, el seguimiento y el tratamiento de las infecciones.

Genetic-relatedness of peri-implants and buccal Candida albicans isolates determined by RAPD-PCR / Relación genética de aislamentos de candida albicans por rapd-pcr en surcos en surcos peri-implantarios de cavidad bucal

Molecular techniques have been used in recent studies toidentify a wide range of potential bacterial pathogens inperi­implant pockets of the oral cavity. However, the prevalence and molecular epidemiology of yeasts and species distribution related to peri­implantitis are as yet unknown. The aim of thisstudy was to determine the prevalence and distribution of yeasts in peri­-implant biofilm and to study genetic relatedness of Candida albicans.Yeasts recovered from peri­implant biofilm samples (n=89) andbuccal samples (n=120) were studied in 40 immunocompetent non­-smoking patients who visited the dental clinic of the Asociación Implantodontológica Argentina, Buenos Aires, Argentina, and had received oral rehabilitation with implants for more than five years. Yeasts recovered from samples were studied by typing assays using RAPD­PCR. The prevalence of yeasts in the peri­implant sulcus was 73% (n=29). C. albicans was the most prevalent species identified in this study population. The RAPD analysis showed identical genotypes inmost C. albicans spp. from the two different sampling sites: buccal and peri­implant. These findings suggest that periimplant biofilm is an ecological niche that favors the growth of yeast species. Most C. albicans found in peri­implant biofilmoriginate from the endogenous infection caused by commensalstrains.

Las técnicas moleculares se han utilizado en estudios recientespara identificar una gran diversidad de patógenos bacterianosde surcos periimplantarios de cavidad bucal. Sin embargo, laprevalencia y epidemiología molecular de especies de levadurasen relación con la periimplantitis son aún desconocidas. Elobjetivo de este estudio fue determinar la prevalencia ydistribución de las levaduras en la biopelícula periimplantaria yestudiar la relación genética de Candida albicans. Se estudiaron40 pacientes inmunocompetentes no fumadores que se asistieronen la clínica dental de la Asociación ImplantodontológicaArgentina, Buenos Aires, Argentina, y que habían recibidorehabilitación oral con implantes durante más de cinco años.Las levaduras aisladas de las muestras de biopelículaperiimplantaria (n = 89) y bucales (n = 120), fueron identificadaspor métodos micológicos tradicionales y moleculares. Se obtuvoel ADN de C. albicans y se realizaron estudios moleculares porRAPD ­PCR. La prevalencia de levaduras en el surco alrededordel implante fue de 73 % (n = 29). C. albicans fue la especie másfrecuente identificada en esta población de estudio. El análisisRAPD permitió identificar idénticos genotipos de C. albicans enambos nichos ecológicos estudiados, periimplantar y bucal.Según los resultados obtenidos, el surco periiplantario es unnicho ecológico que favorece el crecimiento de especies delevaduras del género Candida. La mayoría de los aislamientosde C. albicans periimplantarios se originan a partir de lainfección endógena causada por cepas comensales.

Nasal carriage of Staphylococcus aureus and Candida species in immunocompetent individuals

El propósito de este trabajo fue analizar la prevalencia de Staphylococcus aureus y especies de Candida en muestras demucosa nasal de 100 individuos inmunocompetentes de ambos sexos con edades entre 18-70 años, durante el examen clínico estomatológico. Las muestras fueron obtenidas con hisoposestériles sobre la mucosa de ambas fosas nasales. Se realizó observación en fresco, tinción de Gram, Giemsa y cultivos en medios selectivos y diferenciales a 37ºC para el aislamiento e identificación de los microorganismos seleccionados, pruebas bioquímicas convencionales y equipos comerciales y estudios moleculares mediante la prueba de PCR. Con un termo higrómetro digital se midió la temperatura ambiente cuyo promedio en el momento de la toma en el consultoriofue de 25±2 oC y la humedad relativa ambiente fue del 66±11 por ciento.S aureus se aisló en el 38 por ciento de las muestras y dentro del mismo, 4 por ciento fueron meticilino resistentes (MRSA) siendo genéticamente 2 por ciento de la Comunidad (MRSA-CA) y 2 por ciento Hospitalarios (MRSA-HA).En el 23 por ciento de las muestras fue identificada Candida siendo la especie prevalente C. albicans: 19 por ciento y en menor proporción C. dubliniensis: 3 opr ciento , C. krusei: 1 por ciento. Se registró una asociación significativa entre Candida y S. aureus (Chi-cuadrado=27,75; gl=1; (p<0,001). La cavidad nasal constituye un reservorio yla identificación de género y especie contribuye a la adecuada vigilancia epidemiológica.

Prevalence of Candida species in necrotic pulp with chronic periapical processes

El propósito de este estudio fue identificar especies del géneroCandida en mucosa de cavidad bucal y dientes unirradiculares con necrosis pulpar con procesos periapicales crónicos de origen endodóntico con imágenes radiográficas entre 2±4 mm sin sintomatología clínica en pacientes inmunocompetentes. El estudio incluyó 82 pacientes inmunocompetentes de ambos sexos con edades entre 18-70 años con diagnóstico clínico dentario de necrosis pulpar séptica. Las muestras fueron obtenidas del conducto radicular con conos de papel estéril # 25 y de lamucosa bucal mediante hisopo estéril. Se identificaron 7 especies diferentes de Candida (C. albicans, C. dubliniensis,C. guilliermondii, C. krusei, C. arapsilopsis, C. tropicalis y C. glabrata). Todas estuvieron presentes en mucosa bucal, mientras que dos de ellas (C. parapsilopsis y C. glabrata) nose identificaron en zona periapical de conductos con necrosis Del total de las muestras aisladas de mucosa bucal hubo una frecuencia significativamente mayor de C. albicans que la proporción de estas levaduras en la zona periapical en conductos con necrosis.

Prevalence of Staphylococcus spp and Candida spp in the oral cavity and periodontal pockets of periodontal disease patients

The oral cavity can act as a reservoir of certain pathogens that can cause systemic infections. The periodontal pocket is an ecological niche appropriate for hosting microorganisms that could act as opportunistic pathogens. The ability of Staphylococcus spp and Candida spp to form a biofilm and live within certain niches allows them to develop mechanisms that increase persistence, such as the evasion of host defenses and antibiotic efficacy. These microorganisms can easily be or become resistant to antibiotics and lead to superinfection. The aims of this study were to assess the presence of Staphylococcus aureus and Staphylococcus spp in biofilm in subgingival plaque and oral cavity of individuals with gingival-periodontal disease, to identify isolates and the relationship with Candida spp. The study included eighty-two patients, aged 18-70 years with periodontal disease and at least two sites with probing depth ≥3 mm. Participants’ data were evaluated individually. Subgingival biofilm samples were obtained using Gracey curettes 7/8, after supragingival biofilm removal, and a sample from the oral cavity (buccal mucosa, tongue and cheek mucosa) by sterile swab. Of all the patients studied, 42.7% exhibited Staphylococcus spp in the periodontal pocket and 69.5% in the oral cavity while 25.6% exhibited Candida spp in the periodontal pocket and 42.7% in the oral cavity. However, 13.4% had both microorganisms in the periodontal pocket and 36.6% in the oral cavity. The prevalence of Staphylococcus aureus was 13.4% in the periodontal pocket and 15.8% in the oral cavity. Candida albicans was the most prevalent yeast in the periodontal pocket (76.2%) and in the oral cavity (63.0%).

La cavidad bucal puede actuar como reservorio de ciertos patógenos que pueden producir infecciones sistémicas. La bolsa periodontal es un nicho ecológico propicio para albergar microorganismos que podrian actuar como patógenos oportunistas. La posibilidad que Staphylococcus spp y Candida spp puedan formar un biofilm o biopelícula y vivir dentro de ciertos nichos les permite a estos microorganismos desarrollar ciertos mecanismos que aumentan su persistencia como ser la capacidad de eludir las defensas del huésped y la terapia antimicrobiana. Estos microorganismos pueden ser o fácilmente convertirse en resistentes a los antibióticos y dar origen a una supeinfección. El propósito de este estudio fue evaluar la presencia de Staphylococcus aureus y Staphylococcus spp en biofilm placa subgingival y en cavidad oral en sujetos con enfermedad gingivoperiodontal, identificar los microorganismos aislados y su relación con la portación de Candida spp. El estudio incluyo ochenta y dos pacientes, de edades entre 18 a 70 anos de edad, con enfermedad periodontal, y al menos dos sitios con la profundidad de sondaje ≥ 3 mm. Se evaluaron los datos individuales. Las muestras de biofilm subgingival fueron obtenidas con cureta tipo Gracey 7/8, previa remoción del biofilm supragingival y una muestra de cavidad oral (mucosa, lengua y carrillo) mediante hisopo estéril. Del total de los pacientes estudiados, el 42,7% mostraron Staphylococcus spp en la bolsa y el 69,5% en la cavidad oral, mientras que 25,6% mostraron Candida spp en la bolsa y 42,7% en la cavidad oral. Sin embargo, el 13,4% tenían ambos microorganismos en la bolsa y el 36,6% en la cavidad oral. La prevalencia de Staphylococcus aureus en la bolsa periodontal fue de 13,4% y 15,8% en la cavidad oral. Candida albicans fue la levadura más frecuente en la bolsa periodontal (76,2%) y en la cavidad oral (63,0%).

Subgingival distribution of yeast and their antifungal susceptibility in immunocompetent subjects with and without dental devices

Las levaduras del genero Candida colonizan el biofilm subgingival.Su hallazgo constituye un reservorio favorable para su multiplicación. El propósito de éste trabajo fue investigar la presencia de levaduras del género Candida en el biofilm subgingivalde individuos con enfermedad gingivoperiodontal a fin de establecer la prevalencia de especies y los perfiles desusceptibilidad a fluconazol y voriconazol de las mismas. Se obtuvieron muestras del biofilm subgingival en cien pacientes inmunocompetentes, no fumadores, con salud gingivoperiodontal, gingivitis y periodontitis, con y sin aparatologíabucal. Las muestras se sembraron en medio cromogénico diferencial y las levaduras aisladas se identificaronmediante micromorfología y pruebas bioquímicas. Los estudios de sensibilidad a fluconazol y voriconazol se realizaron según las normas CLSI M44-A. La prevalencia de levadurasen el biofilm subgingival fue del 40 por ciento IC95 por ciento (30.5-50.3) siendo el 10 por ciento y 30 por ciento la frecuencia de las mismas para los pacientes sin y con aparatología bucal respectivamente.C. albicans fue la levadura más frecuente. Encontramos otras especies como C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. guilliermondii y C. sake. Solo se observó resistencia a los azoles en C. dubliniensis y C. guilliermondii. El tratamiento con aparatología bucal incrementó la prevalencia de levadurasen bolsa periodontal en forma significativa. Es importante destacar la presencia en el fluido subgingival de especies de Candida no albicans consideradas emergentes y con sensibilidad disminuida a los antifúngicos como C. dubliniensisy C. guilliermondii

Yeasts colonize the subgingival biofilm, which becomes a reservoir that favors their reproduction. The purpose of the present work was to determine the prevalence of yeasts of the Candida genus in the subgingival biofilm of gingivoperiodontal disease patients, including users and non-users of dental devices, and their susceptibility to fluconazole and voriconazole. Samples of subgingival pockets of immunocompetent nonsmokers showing gingivitis and periodontitis were inoculated in a differential chromogenic medium. Sixty three percent of subjects used dental devices. Yeasts were identified and susceptibility to fluconazole and voriconazole was tested following CLSI M44-A standards. The prevalence of yeasts in the subgingival biofilm was 40% CI 95% (30.5-50.3); 10% were patients who did not use dental appliances. The most frequently observed yeasts were C. albicans, and C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. tropicalis and C. guilliermondii. Only C. dubliniensis and C. guilliermondii showed resistance to azoles. The use of dental devices significantly increased the prevalence of yeasts in periodontal pockets inpatients presenting gingivitis. It is noteworthy that non albicans Candida species, such as C. dubliniensis and C. guilliermondii, considered emerging species, which have a diminished susceptibility to antifungal agents were found in the crevicular fluid of immunocompetent patients.