ABSTRACT
A peptide (SmB2LJ; r175-194) that belongs to a conserved domain from Schistosoma mansoni SmATPDase 2 and is shared with potato apyrase, as predicted by in silico analysis as antigenic, was synthesised and its immunostimulatory property was analysed. When inoculated in BALB/c mice, this peptide induced high levels of SmB2LJ-specific IgG1 and IgG2a subtypes, as detected by enzyme linked immunosorbent assay. In addition, dot blots were found to be positive for immune sera against potato apyrase and SmB2LJ. These results suggest that the conserved domain r175-194 from the S. mansoni SmATPDase 2 is antigenic. Western blots were performed and the anti-SmB2LJ antibody recognised in adult worm (soluble worm antigen preparation) or soluble egg antigen antigenic preparations two bands of approximately 63 and 55 kDa, molecular masses similar to those predicted for adult worm SmATPDase 2. This finding strongly suggests the expression of this same isoform in S. mansoni eggs. To assess localisation of SmATPDase 2, confocal fluorescence microscopy was performed using cryostat sections of infected mouse liver and polyclonal antiserum against SmB2LJ. Positive reactions were identified on the external surface from the miracidium in von Lichtenberg's envelope and, in the outer side of the egg-shell, showing that this soluble isoform is secreted from the S. mansoni eggs.
Subject(s)
Animals , Male , Mice , Antibodies, Helminth/immunology , Antigens, Helminth/immunology , Apyrase/immunology , Schistosoma mansoni/immunology , Blotting, Western , Cross Reactions , Electrophoresis, Polyacrylamide Gel , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , Egg Proteins/immunology , Immunohistochemistry , Schistosoma mansoni/enzymologyABSTRACT
Proteolytic enzymes have a fundamental role in many biological processes and are associated with multiple pathological conditions. Therefore, targeting these enzymes may be important for a better understanding of their function and development of therapeutic inhibitors. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptides are convenient tools for the study of peptidases specificity as they allow monitoring of the reaction on a continuous basis, providing a rapid method for the determination of enzymatic activity. Hydrolysis of a peptide bond between the donor/acceptor pair generates fluorescence that permits the measurement of the activity of nanomolar concentrations of the enzyme. The assays can be performed directly in a cuvette of the fluorimeter or adapted for determinations in a 96-well fluorescence plate reader. The synthesis of FRET peptides containing ortho-aminobenzoic acid (Abz) as fluorescent group and 2, 4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2, 4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp) as quencher was optimized by our group and became an important line of research at the Department of Biophysics of the Federal University of São Paulo. Recently, Abz/Dnp FRET peptide libraries were developed allowing high-throughput screening of peptidases substrate specificity. This review presents the consolidation of our research activities undertaken between 1993 and 2008 on the synthesis of peptides and study of peptidases specificities.
As enzimas proteolíticas têm um papel fundamental em muitos processos biológicos e estão associadas a vários estados patológicos. Por isso, o estudo da especificidade das peptidases pode ser importante para uma melhor compreensão da função destas enzimas e para o desenvolvimento de inibidores. Os substratos com supressão intramolecular de fluorescência constituem uma excelente ferramenta, pois permitem o monitoramento da reação de forma contínua, proporcionando um método prático e rápido para a determinação da atividade enzimática. A hidrólise de qualquer ligação da cadeia peptídica entre o grupo doador e o grupo supressor gera fluorescência que permite detectar concentração nanomolar de enzima. Os ensaios podem ser acompanhados diretamente na cubeta ou adaptados para determinações de fluorescência em leitoras de placa. A síntese dos peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência contendo o grupo fluorescente Abz (orto-aminobenzóico) e o grupo supressor EDDnp (N-[2, 4-dinitrofenil]-etilenodiamino ou Dnp (2, 4-dinitrophenyl) foi otimizada pelo nosso grupo e tornou-se uma importante linha de pesquisa no Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo. Recentemente, foram desenvolvidas bibliotecas de peptídeos fluorogênico contendo Abz/Dnp como grupo doador/supressor trazendo um grande avanço no estudo de especificidade das peptidases. Esta revisão apresenta o trabalho desenvolvido pelo nosso grupo entre 1993 e 2008 sobre a síntese de peptídeos e o estudo da especificidade de peptidases.
Subject(s)
Humans , Fluorescence Resonance Energy Transfer , Neprilysin/metabolism , Peptide Hydrolases/metabolism , Peptides/metabolism , Peptidyl-Dipeptidase A/metabolism , Peptide Hydrolases/chemistry , Substrate SpecificityABSTRACT
O trabalho aqui apresentado representa a consolidação das nossas atividades de pesquisa desenvolvidas entre 1993 e 2001 sobre síntese de peptídeos e estudo de especificidade de proteases. Durante este período instalamos e desenvolvemos metodologias modernas de síntese de peptídeos em fase sólida usando a estratégia Fmoc partindo de uma infra-estrutura que vinhamos estabelecendo desde 1980 para síntese de peptídeos em solução, voltada principalmente para o estudo de substratos e inibidores de proteases. Assim, pudemos desenvolver os seguintes temas:ò Síntese de substratos cromogênicos.ò Síntese de substratos fluorogênicos.ò Síntese de substratos de fluorescência apagada internamente.ò Síntese paralela de peptídeos em fase sólida.ò Síntese de biblioteca de peptídeos.O desenvolvimento de compostos químicos com atividades biológicas, seja mimetizando compostos naturais, seja inibindo suas atividades é o objetivo básico da área de conhecimento denominada Química Farmacêutica ou também Química Médica na língua inglesa (Medicina/ Chemistry). Esta tem sido ao longo do tempo uma ciência empírica na sua essência, embora tenha se tornado bastante sofisticada nas últimas duas décadas. Sínteses orgânicas, biotecnologia, ensaios biológicos elegantes e modelagem por computador são algumas das poderosas técnicas empregadas e que trazem elementos racionais para a pesquisa de novas drogas. O paradigma da Química Médica é descobrir compostos com atividades biológicas desejáveis, uma de cada vez, e a partir destes (compostos líderes) desenhar e ensaiar outros mais potentes e com menor toxicidade. O desenvolvimento da síntese de peptídeos propiciou avanços fundamentais nesta área.