Coexpressão da proteína p53 e proteínas relacionadas a resistência a múltiplas drogas em diferentes tipos de leucemias: associação predominante nos estágios avançados da doença / Coexpression of p53 protein and multidrug resistance proteins in diferents types of leukemias: the predominant association in advanced status of disease

Um dos mais bem caracterizados mecanismos de resistência às drogas (MDR) nas leucemias são os mediados pela glicoproteína P (PGP) e proteína relacionada a múltiplas drogas (MRP). Diversos relatos têm demonstrado que a superexpressão dessas proteínas podem ser medianas pela superexpressão da proteína p53 inativada. O objetivo deste estudo foi investigar a co-expressão da p53, PGP e MRP em diferentes tipos de leucemias pela citometria de fluxo. Analisou-se amostras de 223 pacientes leucêmicos: 64 leucemia linfocítica crônica (LLC), 43 leucemia mielóide aguda (LMA), 44 leucemia linfoblástica aguda (LLA), e 72 leucemia mielóide crônica (LMC). A p53 foi observada em 23,6% na LMC, 21,8% na LLC, 44,2% na LMA e 29,4% na LLA. A Pgp em 46,4% na LMC, 47,5% LLC, 62,8% LMA e 20% LLA e a MRP em 31,9% na LMC, 40,6% na LLC, 44,2% na LMA e 40,1% na LLA. Observou-s co-expressão estatisticamente significativa entre p53 e Pgp na LMC (p=0,0066) e na LMA (p=0,0013) e p53 e MRP na LMC (p=0,000066), na LLC (p=0,0079) e LMA (0,00044), sendo observado predomínio dessas associações nos estágios avançados dessas doenças. Estes resultados demonstraram que as pesquisas desses marcadores possam servir como indicadores de evolução clínica e prognóstico para estas leucemias.

Uso simultâneo do método do polimorfismo conformacional de fita simples e da citometria de fluxo no aumento da eficácia da detecção de anormalidades do gene e da proteína p53 na leucemia mielóide crônica / Simultaneous use of the single strand conformation polymorphism method and flow cytometry for increasing the detection efficacy of abnormalities in the gene and p53 protein in chronic myeloid leukemia

A proteína p53 desempenha um importante papel no controle do ciclo de celular e reparo no DNA danificado. Em pacientes com leucemia de mielóide crônica (LMC) as mutações neste gene são encontradas em até 30% dos casos, especialmente na crise blástica (LMC-CB), sendo a detecção de alterações nesse gene ou proteína importantes na avaliação da evolução clínica da LMC. O sequenciamento de DNA é descrito como o método capaz de identificar as mutações do gene TP53, sendo, no entanto uma técnica complexa e dispendiosa, o que dificulta seu emprego em larga escala, sendo, atualmente, proposto a pesquisa da proteína p53 por métodos imunológicos e a técnica da reação em cadeia da polimerase seguida pelo estudo do polimorfismo conformacional de fita simples (PCR/SSCP). Métodos: Analisaram-se amostras de 72 pacientes com LMC: 54 de LMC em fase crônica (33 fase inicial ou LMC-FCi e 21 em fase crônica tardia ou LMC-FCtd), 7 em fase acelerada ou LMC-Ac e 11 em crise de blástica (LMC-CB). Foram realizados PCR para os exons 5-9 para posterior estudo pelo SSCP e a expressão de proteína de p53 foi feita por citometria de fluxo. Resultados: Na análise do PCR-SSCP, alterações de mobilidade eletroforética indicativa de mutação do gene de TP53 foi observado em 11/72 pacientes e a expressão da proteína p53 em 17/72 pacientes. O SSCP anormal foi visto em dois casos de LMC-FCi (exon 7), quatro LMC-FCt (um exon 7, um exon 8 e dois exons 8-9), um na LMC-FAc (exon 8) e quatro na LMC-CB (dois no exon 5, um no exon 6 e um no exon 8-9). Neste grupo, a proteína de p53 estava expressa sete casos (todas LMC-CB e AC e 2 LMC-FCtd), havendo correlação estatisticamente significativa entre os resultados dos dois métodos. Conclusões: Estes resultados sugerem que os dois métodos conjuntamente empregados podem aumentar a sensibilidade na detecção de anormalidades do gene e proteína p53 nos pacientes com LMC. A presença de SSCP anormal associado à expressão da proteína de p53 nas fases avançadas desta doença na maioria de casos, sugere que estes exames possam se empregados como indicadores de progressão para a LMC.

The p53 protein play an important role in the control of the cell cycle and DNA repair. In patients with chronic myeloid leukemia (CML) mutation in this gene were found in up to 30%, especially among those in blast crisis. At present, the only widely available technology that reliable detects and defines all mutations is DNA sequencing. However, the routine sequencing of the entire TP53 gene in all cases suggestive of mutation in the laboratorial routine is prohibitively costly, complex, and time consuming. To screen for TP53 abnormalities in CML patients, both p53 protein expression bay immunologic methods and single strand conformation polymorphism of polymerase chain reaction products (SSCP-PCR) is proposed. Methods: We report the results of an analysis of 72 samples from CML patients:54 in chronic phase :33 in initial phase (ICP-CML) and 21 in late phase (LCP-CML), 7 in accelerated phase (AP-CML) and 11in blast crisis (BC-CML). DNA structure for 5-9 exons of the TP53 gene were analyzed by PCR-SSCP and p53 protein expression by flow cytometry (CF). Results: By PCR-SSCP analysis, shifts in eletrophoretic mobility of the TP53 gene were detected in 11 out of CML patients and p53 protein expression in 17 out of 72 CML patients. The abnormal SSCP pattern were showed in two cases of ICP-CML (exon 7), four LCP-CML (one exon 7 and exon 8 and two exons 8-9), one in AP-CML (exon 8) and four in BC-CML (two in exon 5, one in exon 6 and one in exon 8-9). In this group, the p53 protein were express in 17 cases (all CB and AC of CML patients and 2 out of 5 LCP samples of CML patients) and the statistical analysis by qui-square test showed correlation between this two tests. Conclusions: These results suggest that the two methods together can increase the sensibility of screening for p53 abnormalities in CML patients. The presence of abnormal SSCP associated to the p53 protein expression in advanced phases of this disease in the most of cases, suggesting that these tests can be used as an indicator of progression of CML.

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e imunocitoquímica / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and immunocytochemistry

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e na indução de apoptose em células geneticamente instáveis. A imunocitoquímica (ICQ) é um dos métodos preconizados para detecção e visualização dessa proteína no núcleo das células, sendo, no entanto um método demorado e trabalhoso o que dificulta a sua aplicação na rotina laboratorial. Atualmente, a citometria de fluxo (CF) também tem sido empregada na detecção da proteína p53 mutada ou estabilizada tendo a vantagem da praticidade e rapidez de execução. Objetivos e Metodologia: Comparar os resultados obtidos pela CF e ICQ na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamos amostras de 10 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA) 10 com leucemia linfóide crônica (LLC), tendo sido também empregadas, células de linhagens leucêmicas humanas que serviram como controle de expressão positiva e negativa para ambos os métodos além de linfócitos de 40 doadores de sangue. A CF e ICQ foram realizadas após a marcação com anticorpo monoclonal anti-p53 por técnicas convencionais. Resultados: Observamos concordância nos resultados da maioria das amostras dos pacientes e em todas as amostras das linhagens elulares tendo sido, no entanto constatados níveis de expressão mais elevados nas análises obtidos pela CF quando comparados com a ICQ, refletindo em uma maior sensibilidade desse método. Conclusão: Apesar da ICQ ser considerada uma técnica adequada para a detecção da p53, nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostras de células leucêmicas.

Introduction: The p53 protein plays a crucial role in the cell cycle control, DNA damage repair and induction of apoptosis in genetically unstable cells. The immunocytochemistry (ICQ) is one of the most common methodology for detection and visualization of this protein in the nucleus of the cells, but this technique is time-consuming and difficult to apply in the clinical setting. Nowadays the assessment of p53 protein expression by flow cytometry (FC) assays are easier to perform and provide reliable estimates of the prolonged half-life of mutant or inactivated wild-type p53 protein. Objectives and Methodology: Compare the results of p53 detection by FC and ICQ in leukemic cells. We used samples from 10 patients with acute lymphoid leukemia (ALL), 10 with chronic lymphoid leukemia (CLL). To positive and negative controls of p53 expression in both methods we also employed leukemic cells from human leukemic cell lines an lymphocytes from 40 healthy donors were also used as control for negative labeling in FC. The FC and ICQ were performed after labeling with p53 monoclonal antibody by the usual protocol. Results: We verified an agreement in the results in the majority of the leukemic cells from patients and in all human leukemic cell line samples. Conclusion: Despite of ICQ is considered a good methodology for p53 detection in leukemic cells; our results show that FC can be satisfactorily used for detection of this protein in leukemic cells.

Chromosome 17 abnormalities and mutation of the TP53 gene: correlation between cytogenetics, flow cytometry and molecular analysis in three cases of chronic myeloid leukemia

Alterations involving the short arm of chromosome 17 (17p) during the progression of chronic myeloid leukemia (CML) have been described. This chromosomal region contains the tumor suppressor gene TP53 that may be an important factor in the evolution of this disease. In this study, we used flow cytometry and western blotting to assess p53 protein expression and single stranded conformational polymorphism to examine TP53 gene alterations in three patients with CML who showed alterations in 17p. Only the case with del(17)(p11) had p53 expression positive by flow cytometry and an abnormal migration pattern by SSCP analysis. The importance of the correlation between the results obtained with these techniques, as well as the clinical course of the patients, are discussed.

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e Western blot / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and Western blot

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e naindução de apoptose em células geneticamente instáveis. O Western blot (WB) é o método preconizado paradetecção dessa proteína, no entanto é técnica demorada e trabalhosa. Atualmente, a citometria de fluxo (CF)também tem sido empregada na detecção da proteína p53 tendo a vantagem da praticidade. Objetivos e Metodologia:Comparar os resultados obtidos pela CF e WB na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamosamostras de 3 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA), 5 com leucemia mielóide aguda (LMA), 6 comleucemia mielóide crônica (LMC) e 8 com leucemia linfóide crônica (LLC). Os controles positivos (5) e negativos(4), para os dois métodos, foram linhagens de células leucêmicas. Juntamente com o controle de marcação negativa,na técnica de CF, utilizamos linfócitos de 40 doadores de sangue. A análise pela CF foi realizada após a marcaçãocom anticorpo monoclonal anti-p53 e o WB por técnica convencional. Resultados e Conclusões: Observamosconcordância nos resultados em 82 por cento das amostras leucêmicas e em 100 por cento nas linhagens celulares. CF+/WB+foram observados em pacientes com evolução desfavorável tais como na LLC / Síndrome de Richter, LMC emcrise blástica e na maioria das LMA. Apesar do WB ser considerado um método padrão para a detecção da p53,nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostrasleucêmicas.

Estudo imunomolecular dos linfomas não hodgkin de origem B na infância: correlação clínica e terapêutica / B non-Hodgkin lymphoma immunological study in childhood: correlation with histological types and therapeutic response

A proteína p53 desempenha um papel central nas respostas celulares dentre as quais se incluem o controle do ciclo e da morte celular induzida por dano ao DNA, como aquele causado por muitos agentes quimioterápicos e radiação utilizados no tratamento do câncer. O propósito deste estudo foi descrever as funções biológicas da proteína p53 e investigar o seu papel nos linfomas não Hodgkin de origem B da infância. Adicionalmente, nós também estudamos os tipos histológicos e a prevalência da infecção pelo vírus Epstein-Barr e sua correlação com os achados clínicos patológicos. Uma série de crianças com linfoma não Hodgkin B foi estudada com relação aos subtipos histológicos, características clínicas, mutações do gene TP53 e expressão das proteínas p53, Ki-67 e mdm2. A detecção de mutações do gene TP53 foi realizada através da técnica de PCR-SSCP dos exons 5-8/9 e seqüenciamento direto em 49 do total de 61 pacientes da série. As mutações do gene TP53 foram detectadas em 22.5por cento dos pacientes analisados, em 20por cento dos pacientes com linfoma de Burkitt. A análise das seqüências destes casos mostrou a presença de mutações do tipo pontual em 10 casos e uma inserção em um caso. A expressão da proteína p53 por imunohistoquímica foi realizada em 48 do total de 61 pacientes com resultados positivos em 31por cento dos casos. A proteína mdm2 foi negativa em todos os casos testados (42casos), incluindo aqueles com mutação do gene TP53. Observou-se uma alta concordância entre a expressão da p53 e a presença de mutações (p=0.0005). Não foi detectada uma correlação estatisticamente significante entre mutações e os achados clínicos. A comparação da sobrevida livre de eventos entre os grupos com e sem mutação usando o teste de Long-Rank também não foi significante. O virus EBV foi analisado por hibridização in situ e estava associado ao LB em 72por cento dos tumores(21/29 pacientes). O tipo 1 infectou a maioria dos casos(28/29). Houve uma tendência de associação entre idade mais baixa e os casos de linfoma de Burkitt associados ao EBV (mediana de 4 anos comparada a 6 anos, respectivamente, p=0.057). Também o nosso estudo sugeriu que na região sudeste do Brasil o LB tem uma associação intermediária com o EBV. Em conclusão, este estudo permitiu contribuir para uma melhor caracterização imunofenotípica e molecular dos linfomas não Hodgkin B da infância no Brasil.

Burkitt-like lymphoma in an infant: a case report

Childhood non-Hodgkin's lymphomas, including Burkitt and Burkitt-like, are rarely diagnosed in infants. A case of B-cell lymphoma in a 13-month-old girl with extensive abdominal disease, ascites, pleural effusion, and tumor lysis syndrome is reported. Phenotypic analysis showed a germinal center B-cell phenotype, and a B-cell clonality was confirmed by polymerase chain reaction. There was no evidence of Epstein-Barr and HIV infection. The case herein reported emphasizes the need for considering the diagnosis of lymphoma even in very young children

Estudo imunomolecular dos linfomas não hodgkin de origem B na infância: correlação clínica e terapêutica

A proteína p53 desempenha um papel central nas respostas celulares dentre as quais se incluem o controle do ciclo e da morte celular induzida por dano ao DNA, como aquele causado por muitos agentes quimioterápicos e radiação utilizados no tratamento do câncer. O propósito deste estudo foi descrever as funções biológicas da proteína p53 e investigar o seu papel nos linfomas não Hodgkin de origem B da infância. Adicionalmente, nós também estudamos os tipos histológicos e a prevalência da infecção pelo vírus Epstein-Barr e sua correlação com os achados clínicos patológicos. Uma série de crianças com linfoma não Hodgkin B foi estudada com relação aos subtipos histológicos, características clínicas, mutações do gene TP53 e expressão das proteínas p53, Ki-67 e mdm2. A detecção de mutações do gene TP53 foi realizada através da técnica de PCR-SSCP dos exons 5-8/9 e seqüenciamento direto em 49 do total de 61 pacientes da série. As mutações do gene TP53 foram detectadas em 22.5por cento dos pacientes analisados, em 20por cento dos pacientes com linfoma de Burkitt. A análise das seqüências destes casos mostrou a presença de mutações do tipo pontual em 10 casos e uma inserção em um caso. A expressão da proteína p53 por imunohistoquímica foi realizada em 48 do total de 61 pacientes com resultados positivos em 31por cento dos casos. A proteína mdm2 foi negativa em todos os casos testados (42casos), incluindo aqueles com mutação do gene TP53. Observou-se uma alta concordância entre a expressão da p53 e a presença de mutações (p=0.0005). Não foi detectada uma correlação estatisticamente significante entre mutações e os achados clínicos. A comparação da sobrevida livre de eventos entre os grupos com e sem mutação usando o teste de Long-Rank também não foi significante. O virus EBV foi analisado por hibridização in situ e estava associado ao LB em 72por cento dos tumores(21/29 pacientes). O tipo 1 infectou a maioria dos casos(28/29). Houve uma tendência de associação entre idade mais baixa e os casos de linfoma de Burkitt associados ao EBV (mediana de 4 anos comparada a 6 anos, respectivamente, p=0.057). Também o nosso estudo sugeriu que na região sudeste do Brasil o LB tem uma associação intermediária com o EBV. Em conclusão, este estudo permitiu contribuir para uma melhor caracterização imunofenotípica e molecular dos linfomas não Hodgkin B da infância no Brasil.

p53 protein plays a central role in cellular responses, including cellcycle arrest and cell death in response to DNA damage such as that caused by many chemotherapeutic agents and radiation used in cancer therapy. The purpose of this study is to provide an outline of the biological functions of p53 and assess the role of p53 in clinical settings of childhood B non-Hodgkin's lymphoma. In order to contribute to the characterization of the B non-Hodgkin's lymphoma in this country, we also studied the prevalence and type of EBV infection and its correlation with demographic and clinical pathologic data. We investigated a series of patients with childhood B non-Hodgkin's lymphoma for hystological subtypes, clinical profiles, TP53 mutations and immunohistochemistry expression of p53, Ki-67 and mdm2 proteins. Screening for p53 mutations was made by polymerase chain reactionstrand conformational polymorphism analysis of exon 5 to 8/9 of the gene and direct sequencing in 49 out of 61 patients. Mutations of TP53 were detected in 22.5% of patients analyzed and more specifically in 20% of Burkitt's lymphoma. The sequence analysis showed missense mutations in 10 cases and an insertion in one case. The p53 immunostaining positivity was performed in 48 out of 61 patients. The overall frequency of p53 immunostaining positivity was 31 %. The mdm2 expression was negative in all cases tested (42 cases) including the patients with TP53 mutations. There was a very good agreement between expression and the presence of TP53 mutation (P = 0.0005). No significant correlation was found regarding age, gender, clinical stage and LDH level and TP53 mutations. Comparisons of EFS curves using the Logtest were also not significant. EBV was detected by in situ hybridization in 21 of 29 BL (72%) and 1 virus infected the majority of EBV positive BLs (18/21). There was a for younger age in children with EBV positive BL compared with EBV negative BL (median age of 4 years, compared to 6 years, respectively; p = 0.056 ). In addition, our study suggested that in the Southeast of Brazil, BL an intermediate association with EBV. In conclusion, with this study it was possible to contribute with a ecular and immunological profile of childhood B non - Hodgkin limphoma in children from Brazil.

p53 e as hemopatias malignas / p53 and hematological malignancies

p53 é um gene supressor tumoral, que codifica uma fosfoproteína nuclear que desempenha um papel importante no controle do ciclo celular, no reparo do DNA e na indução da apoptose. Em condições de stress, particularmente por indução de dano no DNA, a proteína p53 bloqueia o ciclo celular, permitindo dessa forma o reparo do DNA ou promovendo a apoptose. Estas funções são efetuadas pela capacidade transcricional da proteína p53 que ativa uma série de genes envolvidos na regulação do ciclo celular. A forma mutada da p53 é incapaz de controlar a proliferação celular, resultando em reparo ineficiente do DNA e na emergência de célulasgeneticamente instáveis. As alterações mais comuns nas neoplasias são mutações pontuais dentro das seqüências codificantes deste gene. Nas hemopatias malignas, estas mutações, freqüentemente do tipo pontuais, têm sido observadas com menor ocorrência do que em tumores sólidos. Nas neoplasias hematológicas estas alterações são mais observadas na crise blástica da leucemia mielóide crônica, progressão da síndrome mielodisplásica para leucemia mielóide aguda, na transformação do linfoma folicular para linfoma de alto grau, na evolução da leucemia linfóide crônica para síndrome de Richter e recorrência de leucemias agudas. Esta revisão tem como objetivo avaliar as alterações do gene p53 nas hemopatias malignas e discutir o significado clínico destas alterações genéticas na patogenia e prognóstico nessasneoplasias.

p53 gene analysis in childhood B non - Hodgkin's lymphoma

CONTEXT: Mutations or deletions in the tumor-suppressor gene p53 are among the commonest genetic changes found in human neoplasms including breast, lung and bowel cancers. In hematological malignancies, p53 is most often mutated in Burkitt's lymphoma, with p53 mutations present in 30 to 40 percent of tumor samples and in 70 percent of cell lines. OBJECTIVE: To analyze the p53 gene alterations in child patients with B non-Hodgkin's lymphoma. DESIGN: Descriptive study. SETTING: Tertiary oncology care center. PARTICIPANTS: The study investigated 12 patients with childhood B non-Hodgkin's lymphoma (Burkitt's lymphoma). Screening for p53 mutations was done by polymerase chain reaction - single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) analysis of exon 5 to 8/9 of the gene. RESULTS: Abnormal polymerase chain reaction - single strand conformational polymorphism migration pattern was observed in 4 patients (33.3 percent), one on exon 6 and three on exon 7. Positive cases included 2 patients who died from disease. CONCLUSION: These preliminary results suggest that p53 mutations are quite frequent in children with Burkitt's lymphoma and may play a role in lymphoma genesis or disease progression

Biologia e patogênese dos linfomas não Hodgkin de origem B na infância: uma revisão / Biology and pathogenesis of B non-Hodgkin lymphoma in childhood: a review

Os linfomas não Hodgkin de origem B na infância são neoplasias de alto grau de malignidade, predominando os linfomas do tipo Burkitt e não Burkitt. O linfoma de Burkitt apresenta dois subtipos, o endêmico e o esporádico, ambos caracterizados por translocações cromossômicas envolvendo o proto-oncogene c-myc que resultam na perda de regulação desse gene. Embora a função normal do c-myc permaneça enigmática, recentes dados indicam que esse gene desempenha um papel importante em diversos aspectos da biologia celular, incluindo proliferação, diferenciação, metabolismo e apoptose. Nesta revisão são abordados os aspectos epidemiológicos, clínicos e moleculares dos linfomas B da infância e o papel da ativação do gene c-myc associado a mutações dos genes p53 e Rb na patogênese dos linfomas de Burkitt. O papel da infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV), sua relevância na indução da carcinogenese e interação das proteínas virais com proteínas dos genes supressores de tumor é também discutido.