Anti-fibrotic effects of rosmarinic acid on Tenon's capsule fibroblasts stimulated with TGF-ß: therapeutic potential in ocular surgery / Efeito antifibrótico do Ácido Rosmarínico sobre os fibroblastos da Cápsula de Tenon estimulados com TGF-beta2: potencial terapêutico na cirurgia ocular

ABSTRACT Purpose: Collagen deposition and myofibroblast differentiation are critical factors related to excessive scarring in ocular surgeries. This study evaluated the anti-fibrotic activity of rosmarinic acid on rabbit Tenon's capsule fibroblasts stimulated with transforming growth factor- β2. Methods: Primary cultures of rabbit Tenon's capsule fibroblasts were treated with various concentrations of rosmarinic acid for 12 h, in the presence and absence of transforming growth factor-β2. After 48 h, the proliferation index of rabbit Tenon's capsule fibroblasts and the differentiation of myofibroblasts were investigated through immunofluorescence staining for proliferating cell nuclear antigen and alpha smooth muscle actin. An automated cell counter and colorimetric metabolic activity assay were used to evaluate cell number and viability. Collagen expression and production were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction and hydroxyproline assay, respectively. Results: Unstimulated rabbit Tenon's capsule fibroblasts treated with any concentration of rosmarinic acid exhibited diminished collagen expression (p<0.01) but showed no differences in proliferation index. Transforming growth factor-β2 exposure induced myofibroblast differentiation and increased collagen production. Exposure to rosmarinic acid at 1.0 and 3.0 µM concentrations reduced the proliferation index (p<0.02), as well as the collagen expression and hydroxyproline content (p<0.05). Exposure to 3.0 µM rosmarinic acid reduced viability (p=0.035) in unstimulated rabbit Tenon's capsule fibroblasts and cell numbers (p=0.001) in both stimulated and unstimulated rabbit Tenon's capsule fibroblast cultures. Conclusions: Exposure to 1.0 µM rosmarinic acid was noncytotoxic and led to reduced collagen expression and proliferation of stimulated rabbit Tenon's capsule fibroblasts. These findings suggest that rosmarinic acid is a relatively non-injurious anti-fibrotic compound to rabbit Tenon's capsule fibroblasts, with potential application as an adjunctive agent in ocular procedures, particularly in glaucoma surgeries.

RESUMO Objetivo: A deposição de colágeno e a diferenciação de miofibroblastos são fatores chaves relacionados à cicatrização excessiva em cirurgias oculares. Este estudo avaliou a atividade anti-fibrótica do ácido rosmarínico nos fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos estimulados com o fator de crescimento transformador-β2. Métodos: Culturas primárias de fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos foram tratadas com várias concentrações de ácido rosmarínico por 12h, na presença e na ausência do fator de crescimento transformador-β2. Após 48h, o índice de proliferação dos fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos e a diferenciação dos miofibroblastos foram investigados por coloração por imunofluorescência para proliferação de antígeno nuclear celular e α-actina de músculo liso, respectivamente. Um contador automático de células e um ensaio de atividade metabólica colorimétrica foram utilizados para avaliar o número e a viabilidade das células. A expressão e produção do colágeno foram determinadas por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real e ensaio de hidroxiprolina, respectivamente. Resultados: Fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos não estimulados tratados com qualquer concentração de ácido rosmarínico exibiram diminuição de colágeno (p<0,01), mas não mostraram diferenças no índice de proliferação. A exposição ao fator de crescimento transformador-β2 induziu a diferenciação de miofibroblastos e aumentou a produção de colágeno. A exposição ao ácido rosmarínico nas concentrações de 1,0 e 3,0 µM reduziu o índice de proliferação (p<0,02), bem como a expressão de colágeno e a quantificação de hidroxiprolina (p<0.05). A exposição a 3,0 µM de ácido rosmarínico reduziu a viabilidade (p=0,035) de fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos não estimulados e o número de células (p=0,001) em culturas de fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos estimuladas e não estimuladas. Conclusões: A exposição ao ácido rosmarínico 1,0 µM foi não citotóxica e levou à expressão reduzida de colágeno e menor proliferação de fibroblastos da cápsula de Tenon estimulados pelo fator de crescimento transformador-β2. Esses achados sugerem que o ácido rosmarínico é um composto antifibrótico relativamente não lesivo aos fibroblastos da cápsula de Tenon de coelhos, com potencial aplicação como agente adjuvante em procedimentos oculares, particularmente em cirurgias de glaucoma.

Lacrimal gland primary acinar cell culture: the role of insulin / Células acinares de glândula lacrimal em cultura primária: o papel da insulina

ABSTRACT Purpose: The goal of the present study was to establish a protocol for primary culture of lacrimal gland acinar cells (LGACs) and to assess the effect of adding insulin to the culture media. Methods: LGACs were isolated and cultured from lacrimal glands of Wistar male rats. The study outcomes included cell number, viability, and peroxidase release over time and in response to three concentrations of insulin (0.5, 5.0, and 50.0 μg/mL). Results: In LGAC primary culture, cells started to form clusters by day 3. There was a time-response pattern of peroxidase release, which rose by day 6, in response to carbachol. Culture viability lasted for 12 days. An insulin concentration of 5.0 μg/mL in the culture medium resulted in higher viability and secretory capacity. Conclusions: The present method simplifies the isolation and culture of LGACs. The data confirmed the relevance of adding insulin to maintain LGACs in culture.

RESUMO Objetivo: O objetivo do estudo foi estabelecer um protocolo de cultura primária para o isolamento de células acinares da glândula lacrimal (CAGL) e avaliar a relevância de insulina no meio de cultura. Métodos: CAGL foram isoladas e cultivadas a partir das glândulas lacrimais de ratos Wistar machos. Os parâmetros analisados foram: o número de células, viabilidade e secreção da peroxidase ao longo do tempo e em resposta a três concentrações de insulina (0,5; 5,0 e 50,0 μg/ml). Resultados: Na cultura primária de CAGL as células passaram a se agrupar por volta do dia 3. A secreção de peroxidase em resposta ao carbacol aumentou no dia 6. O período de cultura viável foi limitado à 12 dias. Insulina à 5,0 μg/ml no meio de cultura resultou em viabilidade e capacidade secretora maior. Conclusão: o estudo descreveu um método para simplificar o isolamento e cultivo de CAGL. Os dados apresentados confirmam a importância da insulina na manutenção da cultura de CAGL.

Insulin replacement restores the vesicular secretory apparatus in the diabetic rat lacrimal gland / Reposição de insulina restaura o mecanismo secretório da glândula lacrimal de ratos diabéticos

ABSTRACT Purpose: In the lacrimal gland (LG) acinar cells, signaling regulates the release of secretory vesicles through specific Rab and SNARE exocytotic proteins. In diabetes mellitus (DM), the LGs are dysfunctional. The aim of this work was to determine if secretory apparatus changes were associated with any effects on the secretory vesicles (SV) in diabetic rats as well as the expression levels of constituent Rab and members of the SNARE family, and if insulin supplementation reversed those changes. Methods: DM was induced in male Wistar rats with an intravenous dose of streptozotocin (60 mg/kg). One of the two diabetic groups was then treated every other day with insulin (1 IU). A third control group was injected with vehicle. After 10 weeks, Western blotting and RT-PCR were used to compared the Rab and SNARE secretory factor levels in the LGs. Transmission electron microscopy evaluated acinar cell SV density and integrity. Results: In the diabetes mellitus group, there were fewer and enlarged SV. The Rab 27b, Rab 3d, and syntaxin-1 protein expression declined in the rats with diabetes mellitus. Insulin treatment restored the SV density and the Rab 27b and syntaxin expression to their control protein levels, whereas the Vamp 2 mRNA expression increased above the control levels. Conclusions: Diabetes mellitus LG changes were associated with the declines in protein expression levels that were involved in supporting exocytosis and vesicular formation. They were partially reversed by insulin replacement therapy. These findings may help to improve therapeutic management of dry eye in diabetes mellitus. .

RESUMO Objetivo: Células acinares da glândula lacrimal (GL) sinalizam a regulação da liberação através de vesículas secretórias específicas Rab proteínas exocitóticas SNARE. No diabetes mellitus (DM), as glândulas lacrimais são disfuncionais. O objetivo deste trabalho foi determinar se em ratos diabéticos, alterações dos aparatos secretórios estão associados a efeitos sobre vesículas secretoras (VS) e sobre os níveis de expressão do constituinte Rab, bem como membros da família SNARE, e se a suplementação de insulina reverte as alterações. Métodos: DM foi induzido em ratos Wistar machos com uma dose intravenosa de estreptozotocina (60 mg/kg). Um dos dois grupos diabéticos foi então tratado a cada dois dias com insulina (1 UI). Um terceiro grupo controle foi injetado com o veículo. Após 10 semanas, western blot e RT-PCR comparou níveis de fatores secretórios de Rab e SNARE na glândula lacrimal. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) avaliaram a densidade e integridade de VS de célula acinar. Resultados: No grupo diabetes mellitus , houve poucas e alargadas VS. Rab27b, Rab 3d e Sintaxina-1 diminuiu a expressão da proteína em ratos com Diabetes Mellitus. O tratamento com insulina restaurou a densidade das VS e expressão de Rab 27b e Sintaxina para seus níveis de proteína controle, enquanto a expressão de Vamp 2 RNAm aumentou em relação aos controles. Conclusões: Alterações na glândula lacrimal de diabetes mellitus estão associadas a reduções nos níveis de expressão de proteínas envolvidas no apoio a exocitose e formação vesicular. Eles são, em parte, revertida por terapia de reposição de insulina. Estes resultados podem ajudar a melhorar a conduta terapêutica do olho seco no diabetes mellitus. .

Lacrimal osmolarity and ocular surface in experimental model of dry eye caused by toxicity / Osmolaridade lacrimal e superfície ocular em modelo de olho seco por toxicidade

Purpose: Describe an animal model of dry induced by topical instillation of BAK and evaluate ocular surface biomarkers and histological findings. Methods: Male Wistar rats were used.Topical instillation of 0.2% BAK eyedrops twice a day during 7 days, in the right eye of each animal, while the other eye was taken as control. After 7 days treatment, we performed evaluation of tear film osmolarity, the red phenol thread and ocular surface staining with fluorescein and lissamine green. Afterwards, the animals were sacrificed for tissue extraction and histological evaluation under optical microscopy and H&E staining. Results: Compared with untreated controls, the BAK-group presented tear secretion significantly decreased, increased ocular surface staining by fluorescein and lissamine green and tear film hyperosmolarity (p <0,05). Histological evaluation revealed epithelial thinning and estromal oedema. Conclusions: A toxicity animal model of dry eye induced by topical instillation of benzalkonium chloride, which presents corneal and ocular surface alterations, decreased tear film volume and tear hyperosmolarity as seen in dry eye condition.

Objetivo: Descrever um modelo animal de olho seco induzido pela aplicação tópica de cloreto de benzalcônio (BAC) e avaliar marcadores de integridade da superfície ocular e os achados histológicos. Métodos: Foram utilizados ratos wistar machos adultos. Foi realizada a administração tópica de colírio de BAC 0,2% no olho direito de cada animal duas vezes por dia, durante 7 dias, sendo o olho contralateral tido como controle. Após o tratamento foi realizada a avaliação da osmolaridade do filme lacrimal, o teste de fenol vermelho e a coloração com fluoresceína e lisamina verde. Os animais foram sacrificados e os tecidos extraídos para o estudo histológico da córnea, por microscopia óptica, corada com hematoxilina eosina (H&E). Resultados: Comparados com os controles não tratados o grupo BAC apresentou diminuição significativa na secreção lacrimal, defeitos na integridade epitelial da superfície ocular marcada por corantes vitais, fluoresceína e lisamina verde além do aumento da osmolaridade do filme lacrimal (p < 0,05). À avaliação histológica observou-se diminuição da espessura do epitélio e edema estromal induzidos pela aplicação de BAC. Conclusão: O modelo animal de olho seco por toxicidade induzido pela aplicação tópica de cloreto de benzalcônio apresentou alterações estruturais da córnea e da superfície ocular, diminuição do volume lacrimal e hiperosmolaridade da lágrima características dessa condição.

Efeito do dinitrato de isossorbida sobre a hiperalgesia corneana induzida por lipopolissacarídeo / Isosorbide dinitrate effect on corneal hyperalgesia induced by lipopolysaccharide

OBJETIVO: Avaliar o efeito do dinitrato de isossorbida (DNI) sobre a hiperalgesia corneana e a infiltração de neutrófilos em um modelo experimental de ceratite superficial induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS). MÉTODOS: A hiperalgesia foi estudada através da indução de uma ceratite inflamatória em ratos (n = 60), pela exposição da córnea ao LPS (LPS +). Após a exposição, os olhos foram tratados durante quatro dias, com as soluções tópicas: DNI (200 mg, 65 mg e 20 mg), prednisolona 1 por cento (PRED) ou Veículo. Olhos controles foram expostos apenas à solução salina (LPS -). Para avaliar a dor ocular, contouse o número de piscadas em 40 segundos, após instilação de uma gota de capsaicina 0,01 mM. A análise histopatológica foi realizada para avaliação da infiltração neutrofílica. RESULTADOS: Foram observadas áreas esbranquiçadas no estroma corneano dos olhos com a ceratite induzida pelo LPS, entre os dias 3 e 15 dias. Esses olhos (LPS +) apresentaram um número significativamente maior de piscadas que os LPS - (P = 0,019) à estimulação química. O tratamento tópico com o DNI reduziu o número de piscadas observadas (P = 0,010). Da mesma forma, olhos expostos ao LPS e tratados com DNI demonstraram redução significativa na infiltração neutrofílica (P = 0,0031). CONCLUSÃO: Baixas doses de DNI reduziram a hiperalgesia corneana e a infiltração neutrofílica nesse modelo de ceratite. Dessa forma, doadores de óxido nítrico, como o DNI, poderão ser úteis no futuro ao tratamento clínico de diversas condições dolorosas da superfície ocular.

PURPOSE: To analyze effects of isosorbide dinitrate (DNI) on corneal hyperalgesia and neutrophil infiltration in an experimental model of superficial keratitis induced by lipopolysaccharide (LPS). METHODS: Hyperalgesia was studied through the induction of inflammatory keratitis in rats (n=60), by corneal exposure to LPS. Following exposure, the inflamed eye was treated for four days, with one of the following solutions: topical DNI (200 λg, 65 λg and 20 λg), prednisolone 1 percent (PRED), and vehicle. Saline-exposed eyes (LPS -) underwent the same protocol. To evaluate ocular pain, the number of blinks in 40 seconds was counted, after one drop of 0.01 λM capsaicin. Histopathological analysis was performed with evaluation of neutrophil infiltration. RESULTS: White clouding areas were observed in the corneal stroma of eyes with LPS-induced keratitis, between day 3 and day 15. Eyes exposed to LPS had a significantly higher number of blinks than LPS - (P=0.019). Topical treatment of LPS-induced keratitis eyes with DNI reduced capsaicin-induced blinks (P=0.010). Similarly, eyes exposed to LPS and treated with DNI also displayed reduced neutrophil infiltration (P=0.0031). CONCLUSION: Low doses of topical NO donors, like DNI, reduce corneal hyperalgesia and neutrophil infiltration in this keratitis model. NO donors may be useful in the clinical treatment of painful conditions associated with surgical procedures of the ocular surface.

Tear film and ocular surface changes in diabetes mellitus: [review] / Alterações do filme lacrimal e da superfície ocular no diabetes mellitus: [revisão]

Diabetes mellitus and its clinical association with dry eye and ocular surface are becoming a frequent and sometimes complicate problem in Ophthalmology. Epidemiological data show that an increase in the number of patients with this association is expected following the trend to rise of the disease. The present work reviews the clinical and functional aspects of this problem. The observations indicate that metabolic, neuropathic and vascular tissue damages lead to an inflammatory process and functional degeneration. The physiopathological mechanism include hyperglycemia, advanced glycated end product accumulation, oxidative stress and inflammation mediated by NF-κB signaling pathways. Potential treatments enlightened by those findings would include antioxidant, anti-inflammatory, secretagogues and/or anabolic agents that would mimic insulin effects.

O diabetes mellitus e sua associação clínica com olho seco e doença da superfície ocular estão se tornando um problema freqüente e muitas vezes complicado em oftalmologia. Os dados epidemiológicos mostram que o número de casos deve crescer acompanhando a tendência de aumento da incidência da doença. Esse trabalho revê seus aspectos clínicos e funcionais. As observações indicam que as lesões metabólicas, neuropáticas e vasculares levam a um processo inflamatório e degeneração funcional. Os mecanismos fisiopatológicos incluem hiperglicemia, acúmulo de produtos finais de glicosilação avançada, estresse oxidativo e inflamação mediada pelas vias de sinalização do NF-kB. Os tratamentos potenciais sugeridos por essas observações incluiriam antioxidantes, antiinflamatórios, secretagogos e/ou agentes anabólicos com efeitos miméticos ao da insulina.

Tear film and ocular surface alterations in chronic users of antiglaucoma medications

PURPOSE: Tear film can be altered by chronic medications that may disrupt the equilibrium responsible for the functioning of the lacrimal gland and ocular surface. The purpose of this study was to determine if antiglaucomatous chronic treatment induced alterations in the tear film and ocular surface. METHODS: After informed consent, 21 patients using antiglaucomatous eye drops for more than 8 months and 20 age- and sex-matched volunteers without eye and systemic medications (control group) were enrolled. The data of ocular discomfort, fluorescein and lisamine green staining, tear film break-up time and Schirmer test were collected and compared by Student's t test. The impression cytology data were graded and compared by chi-square test. RESULTS: Patients chronically using antiglaucomatous medications presented with significant higher fluorescein staining (p=0.003), lisamine green staining (p=0.02) and lower TFBUT (p=0.001). The other comparedparameters, including impression cytology were similar between the treated and control group (p>0.05). CONCLUSIONS: The present study shows that the tear film and the ocular surface are altered in patients under antiglaucomatous medications. In common, all medications were preserved with benzalkonium chloride. Efforts to minimize the adverse effects of chronic use of antiglaucomatous drugs must be addressed.

OBJETIVO: O filme lacrimal pode ser alterado por medicações crônicas, que podem comprometer o equilíbrio responsável pela função da glândula lacrimal e da superfície ocular. O objetivo desse estudo foi determinar se o tratamento crônico com drogas antiglaucomatosas induz alterações no filme lacrimal e superfície ocular. MÉTODOS: Após o consentimento informado, 21 pacientes usando drogas antiglaucomatosas por mais de 8 meses e 20 voluntários com similar distribuição etária e por sexo, não usuários de medicação ocular ou sistêmica (grupo controle) foram incluídos. Os dados do desconforto ocular, coloração com fluoresceína e lissamina verde, tempo de ruptura do filme lacrimal e teste de Schirmer foram colhidos e analisados pelo teste t de Student. A citologia de impressão foi avaliada e comparada pelo teste de qui-quadrado. RESULTADOS: Pacientes usando cronicamente medicação antiglaucomatosa apresentaram ignificativamente maior coloração por fluoresceína (p=0,003), lissamina verde (p=0,02) e menor TRFL (p=0,001). Os outros parâmetros comparados, incluindo a citologia de impressão foram similares entre o grupo tratado e controle (p>0,05). CONCLUSÕES: Esse estudo demonstra que o filme lacrimal e a superfície ocular estão alterados em usuários de medicação antiglaucomatosa. Essas medicações apresentam em comum o cloreto de benzalcônio como conservante. Esforços para minimizar efeitos adversos do uso crônico de drogas antiglaucomatosas devem ser considerados.