ABSTRACT
Objective: to analyze the dhaT gene, one of the genes responsible for the 1,3-propanediol (1,3-PD) production, in two native Clostridium strains. Materials and methods: The dhaT gene was amplified by Polimerase Chain Reaction with specific primers designed from Clostridium butyricum VPI1718 operon. Bioinformatics tools like BLASTN, ORF finder, BLASTP and ClustalW were used to determine the identity of the sequence and to assign a function. Results: DNA amplification products were obtained from Colombian Clostridium sp. native strains (IBUN 13A and IBUN 158B) and the Clostridium butyricum DSM 2478 strain, which were sequenced. According to the bioinformatics analysis of the above sequences, a high degree of similarity was found with the dhaT gene of different bacterial species. The highest percentage of identity was obtained with the Clostridium butyricum VPI 1718 strain. Conclusion: knowledge of the physical structure of the 1,3-PD operon in native strains opens the way for developing genetic and metabolic engineering strategies for improving processes productivity.
Objetivo: Analizar el gen dhaT, uno de los responsables de la producción de 1,3-propanodiol (1,3-PD), en dos cepas nativas de Clostridium. Materiales y métodos: El gen dhaT fue amplificado por Reacción en Cadena de la Polimerasa, por medio de cebadores específicos diseñados a partir del operon de Clostridium butyricum VPI1718. Herramientas bioinformáticas como BLASTN, ORF finder, BLASTP y ClustalW se usaron para determinar la identidad de la secuencia y asignarle una función. Resultados: Se obtuvieron productos de amplificación de DNA a partir de cepas nativas Colombianas de Clostridium sp. (IBUN 13A y IBUN 158B) y de la cepa Clostridium butyricum DSM 2478, que posteriormente fueron secuenciados. De acuerdo a los análisis bioinformáticos de las secuencias mencionadas, se encontró un alto grado de similitud con el gen dhaT de diferentes especies bacterianas. El más alto porcentaje de identidad se obtuvo con la cepa Clostridium butyricum VPI 1718. Conclusión: El conocimiento de la estructura física del operón 1,3-PD en cepas nativas, abre las puertas al desarrollo de estrategias genéticas y de ingeniería metabólica para mejorar la productividad del proceso.
Objetivo: Analisar o gene dhaT, um dos responsáveis pela produção de 1,3-propanodiol (1,3-PD) em duas cepas nativas de Clostridium. Materiais e métodos: O gene dhaT foi amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase, usando cevadores específicos sintetizados a partir do operon de Clostridium butyricum VPI1718. Ferramentas de bioinformática, tais como BLASTN, ORF finder, BLASTP e ClustalW foram utilizadas para determinar a identidade da seqüência e atribuir-lhe uma função. Resultados: Obtiveram-se produtos de amplificação do ADN a partir das cepas nativas colombianas de Clostridium sp. (IBUN 13A e IBUN 158B) e da cepa Clostridium butyricum DSM 2478, que foram posteriormente seqüenciados. Segundo a análise bioinformática das seqüências acima mencionadas, encontrou-se um elevado grau de similaridade com o gene dhaT de diferentes espécies bacterianas. A maior porcentagem de identidade foi obtida com a cepa Clostridium butyricum VPI 1718. Conclusão: O conhecimento da estrutura física do operon 1,3-PD em cepas nativas, abre as portas ao desenvolvimento de estratégias de genética e engenharia metabólica para melhorar a produtividade do processo.
ABSTRACT
El objetivo de este estudio fue analizar las rutas metabólicas para la producción de solventes y degradación de celulosa en cepas colombianas promisorias del género Clostridium. Para ello se diseñaron sondas de hibridación que sirvieran para posteriores estudios de mejoramiento genético de las cepas. Se construyó la base de datos denominada MULTICLOST en Microsoft Access® con las secuencias de 485 genes involucrados en las rutas metabólicas arriba mencionadas, provenientes de 45 especies bacterianas y 10 especies fúngicas. Los genes fueron agrupados de acuerdo al tipo de enzima y a los dominios catalíticos o de unión a sustrato en el caso de las celulasas. Cada grupo se sometió a alineamiento múltiple en ClustalW 1.83 y con base en los resultados se crearon subgrupos de similitud mayor al 50%. Se localizaron secuencias conservadas de longitud mayor a 19 nucleótidos en GeneDoc 2.6.002 y sus valores termodinámicos fueron estimados con GeneRunner v3.05, mientras que la sensibilidad y especificidad fue verificada por búsquedas en GenBank usando BLASTN 2.2.8. En total se obtuvieron 94 secuencias conservadas con las siguientes características: longitud promedio de 24 nucleótidos, Tm promedio de 65,8 ºC y contenido de (G+C) entre 14,3 y 60,0%. Se determinó que ninguna de las sondas diseñadas forma estructuras secundarias estables con Tm superior a 36,1 ºC. De acuerdo a sus características y valores termodinámicos, todas las sondas podrían ser utilizadas en la construcción de un microarreglo o en reacciones de PCR para la identificación de regiones relevantes en el mejoramiento del proceso por ingeniería metabólica.
The goal of the present study was to analyze the metabolic pathways involved in solvent production and cellulose consumption by promising Colombian native strains of the genus Clostridium. Therefore a set of oligonucleotide probes was designed, with the aim of analyzing potential targets for genetic improvement of the Colombian strains. The database named MULTICLOST was created in Microsoft Access® using the sequences from 485 genes involved in solventogenesis, 1,3propanodiol production and cellulolysis from 45 bacterial and 10 fungal species. The genes were grouped according to their respective enzyme function and to the catalytic domain or the substrate binding domain in the case of cellulases. ClustalW 1.83 was used for multiple alignment of every group. Subgroups of sequences with more than 50% identity among themselves were created. Conserved sequences longer than 19 nucleotides were identified using GeneDoc 2.6.002 and their thermodynamic values were calculated with GeneRunner v3.05, while their sensitivity and specificity were verified by searching in GenBank with BLASTN 2.2.8. Ninetyfour conserved sequences were obtained with an average 24nucleotide length, 65.8ºC average Tm and a (G+C) content between 14.3% and 60.0%. None of these probes forms stable secondary structures at temperatures higher than 36.1ºC. According to the former results, all of the probes could be used in an oligonucleotide microarray or in PCR reactions for the identification of metabolic targets for improvement of the industrial process.