Produção de interleucina-1beta e severidade da mastite pós-inoculação de Staphylococcus aureus na glândula mamária de bovinos e bubalinos / Interleukin - 1β production and severity of mastitis post-inoculation of Staphylococcus aureus in the mammary gland of bovines and bubalines

O presente trabalho objetivou avaliar, em vacas e em búfalas submetidas à mastite induzida por inoculação de Staphylococcus aureus, a concentração da citocina pró-inflamatória interleucina-1β (IL-1β), a contagem de células somáticas (CCS) e a correlação destas com alguns parâmetros da resposta local e sistêmica à inflamação. Os animais tiveram uma glândula mamária inoculada e o processo inflamatório foi monitorado pela cultura bacteriológica do leite, CCS, quantificação da IL-1β na secreção láctea, avaliação da aparência/consistência da glândula, aparência da secreção láctea (resposta localizada à inflamação) e aferição da temperatura retal (resposta sistêmica à inflamação). Houve elevação nos níveis de IL-1β, na CCS e resposta localizada e sistêmica à inflamação, tanto na espécie bovina como na bubalina. A cinética da produção da citocina foi diferente nas duas espécies (P<0,05), sendo que as búfalas apresentaram elevação mais rápida, porém com níveis menos elevados, quando comparadas às vacas. As duas espécies alcançaram contagens máximas semelhantes (P>0,05) de CS/mL de leite, com concentrações diferentes (P<0,05) de IL-1β/mL de leite. Os parâmetros utilizados para verificar a resposta localizada à inflamação demonstraram escores médios mais elevados na espécie bovina. Correlação positiva entre a concentração da IL-1β no leite, CCS e parâmetros utilizados para avaliar a severidade da mastite foi verificada somente na espécie bovina. Os resultados evidenciaram que a cinética de produção ...

This study aimed to analyze in cows and buffaloes, submitted to mastitis induced by inoculation of S. aureus, the concentration of the pro-inflammatory cytokine interleukin-1beta (IL-1β), the somatic cell count (SCC), and their correlation with some parameters of local and systemic response to inflammation. The animals had one mammary gland inoculated and the inflammatory process was monitored by milk culture, SCC, IL-1β measurement in the milk, evaluation of the gland appearance/consistency, milk secretion appearance (localized response to inflammation) and rectal temperature measurement (systemic response to inflammation). There was increase in the levels of IL-1β, SCC, and both local and systemic inflammatory response, in bovine and bubaline species. The production kinetics of the cytokine was different between the two species (P<0.05). Buffaloes showed a faster increase but achieved lower levels of interleukin-1beta, when compared to cows. Both species reached similar maximum counts (P>0.05) of SC/milk mL, with different concentrations (P<0.05) of IL-1β/mL. The parameters used to verify the local response to inflammation showed higher mean scores in bovine specie. Positive correlation between IL-1β concentration in the milk, SCC and parameters used to analyze the severity of mastitis was verified only in the bovine specie. The results evidenced that the kinetics of IL-1β production was different in the bovine and bubaline species, and demonstrated that the buffaloes developed a milder inflammatory process with faster recovery of the parameters used for mastitis severity evaluation.

Estudo dos mecanismos da atividade imunomoduladora de lipídeos de Schistosoma mansoni mediada por receptores TLR2

O acúmulo de eosinófilos é uma característica marcante da inflamação associada com doenças parasitárias helmínticas. Neste trabalho foi avaliado o papel de lipídeosd derivados de S. mansoni nos mecanismos de recrutamento e ativação de eosinófilos nas infecções causadas por S. mansoni. Além disso, foi também investigado o papel de lipídeos esquistossomais na ativação do metabolismo liídico em macrófagos. Foi observado que camundongos com ausência de TRL2 funcional exibiram um reduzido granuloma eosinofílico no fígado de animais infectados quando comparados com os animais selvagens dentro de 95 dias de infecção por S. mansoni. Além disso, a infecção por S. mansoni induziu acúmulo peritoneal de eosinófilos e formação de corpúsculos lipídicos em eosinófilos numa via de sinalização dependente de TLR2. Os resultados mostraram que estimulação de macrófagos peritoneais in vitro por lipídeos esquistossomais, e por lisofosfatidilcolina (LPC), induziu ativação de NF-κb e produção de citocinas. A administração de LPC in vivo também induziu recrutamento e ativação de eosinófilos, bem como produção de IL-5, IL-13 e eotaxina, num mecanismo largamente dependente de TLR2. A estimulação de eosinífilos humanos in vitro por lipídeos esquistossomais induziu produção de mediadores lipídicos, formação de corpúsculos lipídicos e aumento da expressão de TLR2 e MyD88 nessas células. Lipídeos esquistossomais exibiram significativas quantidades de PGD2 detectada por EIA e foi capaz de induzir produção de 14,15L TC4 (eoxina) e LTC4 através de receptores CRTH2.

Um aumento da expressão de PGD sintase em eosinófilos após a estimulação também foi observada, sugerindo que PGD2 endógena também deve participar na reação mediada por eoxina e LTC4. Utilizando anticorpos neutralizantes contra TLR2, foi demontrado que lipídeos esquistossomas, principalmente através de LPC, induziram formação de corpúsulos lipídicos e produção de eoxina e LTC4 depedente de TLR2. em adição, a LPC esquistossomal também induziu aumento da expressão de PPARγ, formação de corpúsculos lipídicos e produção de citocinas mediada por PPARγ, e geração de LTB4, PGE2, 5-LO e COX2 em macrófagos murinos in vitro. Juntos, esses dados mostram que lipídeos esquistossomais, e em particular a LPC, estão nvolvidos na ativação in vivo de eosinófilos através de vias dependentes de TLR2 em infecção por S. Mansoni. De forma similar, lipídeos esquistossomais induzem ativação in vitro de eosinófilos, indicando um papel dessas moléculas na produção de eoxinas proinflamatórias e induzindo imunidade inata através de vias dependentes de TRL2 e PGD2 em eosinófilos humanos. Por fim, vias de PPARγ também são ativadas por liídeos esquistossoais, sugerindo que estes lipídeos poderiam estar modulando o metabolismo lipídico do hospedeiro

Estudo dos mecanismos da atividade imunomoduladora de lipídeos de Schistosoma mansoni mediada por receptores TLR2 / Study of the mechanisms of immunomodulatory activity of lipids of Schistosoma mansoni receptor mediated TLR2

O acúmulo de eosinófilos é uma característica marcante da inflamação associada com doenças parasitárias helmínticas. Neste trabalho foi avaliado o papel de lipídeosd derivados de S. mansoni nos mecanismos de recrutamento e ativação de eosinófilos nas infecções causadas por S. mansoni. Além disso, foi também investigado o papel de lipídeos esquistossomais na ativação do metabolismo liídico em macrófagos. Foi observado que camundongos com ausência de TRL2 funcional exibiram um reduzido granuloma eosinofílico no fígado de animais infectados quando comparados com os animais selvagens dentro de 95 dias de infecção por S. mansoni. Além disso, a infecção por S. mansoni induziu acúmulo peritoneal de eosinófilos e formação de corpúsculos lipídicos em eosinófilos numa via de sinalização dependente de TLR2. Os resultados mostraram que estimulação de macrófagos peritoneais in vitro por lipídeos esquistossomais, e por lisofosfatidilcolina (LPC), induziu ativação de NF-κb e produção de citocinas. A administração de LPC in vivo também induziu recrutamento e ativação de eosinófilos, bem como produção de IL-5, IL-13 e eotaxina, num mecanismo largamente dependente de TLR2. A estimulação de eosinífilos humanos in vitro por lipídeos esquistossomais induziu produção de mediadores lipídicos, formação de corpúsculos lipídicos e aumento da expressão de TLR2 e MyD88 nessas células. Lipídeos esquistossomais exibiram significativas quantidades de PGD2 detectada por EIA e foi capaz de induzir produção de 14,15L TC4 (eoxina) e LTC4 através de receptores CRTH2.

Um aumento da expressão de PGD sintase em eosinófilos após a estimulação também foi observada, sugerindo que PGD2 endógena também deve participar na reação mediada por eoxina e LTC4. Utilizando anticorpos neutralizantes contra TLR2, foi demontrado que lipídeos esquistossomas, principalmente através de LPC, induziram formação de corpúsulos lipídicos e produção de eoxina e LTC4 depedente de TLR2. em adição, a LPC esquistossomal também induziu aumento da expressão de PPARγ, formação de corpúsculos lipídicos e produção de citocinas mediada por PPARγ, e geração de LTB4, PGE2, 5-LO e COX2 em macrófagos murinos in vitro. Juntos, esses dados mostram que lipídeos esquistossomais, e em particular a LPC, estão nvolvidos na ativação in vivo de eosinófilos através de vias dependentes de TLR2 em infecção por S. Mansoni. De forma similar, lipídeos esquistossomais induzem ativação in vitro de eosinófilos, indicando um papel dessas moléculas na produção de eoxinas proinflamatórias e induzindo imunidade inata através de vias dependentes de TRL2 e PGD2 em eosinófilos humanos. Por fim, vias de PPARγ também são ativadas por liídeos esquistossoais, sugerindo que estes lipídeos poderiam estar modulando o metabolismo lipídico do hospedeiro

Estudo dos mecanismos da atividade imunomoduladora de lipídeos de Schistosoma mansoni: o papel de TLR2, PPar(gama) e PGD2 / Study of the mechanisms of immunomodulatory activity of lipids of Schistosoma mansoni: the role of TLR2, PPAR (gamma) and PGD2

O acúmulo de eosinófilos é uma característica marcante da inflamação associada com doenças parasitárias helmínticas. Neste trabalho foi avaliado o papel de lipídeosd derivados de S. mansoni nos mecanismos de recrutamento e ativação de eosinófilos nas infecções causadas por S. mansoni. Além disso, foi também investigado o papel de lipídeos esquistossomais na ativação do metabolismo liídico em macrófagos. Foi observado que camundongos com ausência de TRL2 funcional exibiram um reduzido granuloma eosinofílico no fígado de animais infectados quando comparados com os animais selvagens dentro de 95 dias de infecção por S. mansoni. Além disso, a infecção por S. mansoni induziu acúmulo peritoneal de eosinófilos e formação de corpúsculos lipídicos em eosinófilos numa via de sinalização dependente de TLR2. Os resultados mostraram que estimulação de macrófagos peritoneais in vitro por lipídeos esquistossomais, e por lisofosfatidilcolina (LPC), induziu ativação de NF-Kb e produção de citocinas. A administração de LPC in vivo também induziu recrutamento e ativação de eosinófilos, bem como produção de IL-5, IL-13 e eotaxina, num mecanismo largamente dependente de TLR2. A estimulação de eosinífilos humanos in vitro por lipídeos esquistossomais induziu produção de mediadores lipídicos, formação de corpúsculos lipídicos e aumento da expressão de TLR2 e MyD88 nessas células. Lipídeos esquistossomais exibiram significativas quantidades de PGD2 detectada por EIA e foi capaz de induzir produção de 14,15L TC4 (eoxina) e LTC4 através de receptores CRTH2. Um aumento da expressão de PGD sintase em eosinófilos após a estimulação também...

Diagnóstico da infecção por trematódeos em moluscos através de Multiplex-PCR

A Fasciola hepatica têm despertado interesse médico e veterinário nos últimos anos, uma vez que, os casos de fasciolose humana e animal se tornam cada vez mais freqüentes em todo o mundo. Da mesma forma, o S. mansoni continua sendo estudado em decorrência de seu grande impacto sócio-econômico e na saúde pública. O diagnóstico clássico da infecção de S. mansoni em Biomphalaria bem como de F. hepatica em limneídeos é feito rotineiramente em laboratório através de exames dos moluscos após estímulo luminoso (exposição à luz artificial) para observação de cercárias, e/ou dissecando ou esmagando os moluscos, onde além de se observar cercárias também observa-se a presença de rédias (no caso de F. hepatica) e esporocistos, principalmente se estes estiverem localizados na glândula digestiva. Entretanto o encontro de larvas de helmintos em moluscos quase sempre traz resultados inconclusivos, uma vez que existe uma grande semelhança morfológica entre formas intramolusco de trematódeos. No presente trabalho, foi desenvolvido um diagnóstico molecular rápido e eficaz capaz de detectar F. hepatica e S. mansoni em seus hospedeiros intermediários

Com o intuito de detectar a infecção de S. mansoni e, simultaneamente identificar a espécie de Biomphalaria, utilizamos a Multiplex-PCR para amplificar a região ITS2 dos caramujos e a região do DNAmt desse trematódeo, utilizando simultanemente 6 iniciadores. Esse procedimento permitiu diagnosticar a infecção pelo S. mansoni e realizar a identificação espécie-específica do molusco parasitado, em uma única reação (artigo 1). Para a detectar a infecção de limneídeos por F. hepatica realizamos a Multiplex-PCR, utilizando 4 iniciadores em uma única reação, sob condições de alta estringência, permitindo a amplificação específica do DNA do trematódeo e do molusco (artigo 2). Este método foi altamente sensível, detectando a infecção por até um miracídio de F. hepatica no período pré-patente da infecção, não amplificando DNA de outros trematódeos. Além da especificidade, a Multiplex-PCR também permite o uso de um eficiente controle interno da reação pela amplificação do DNA do molusco. A via migratória e as alterações histopatológicas causadas por helmintos em moluscos têm sido estudadas através de técnicas histológicas

Diante das dificuldades encontradas em se identificar especificamente a presença de trematódeos em limneídeos através apenas da análise de cortes histológicos sob microscópio de campo claro, padronizamos um método sensível capaz de extrair DNA de cortes histológicos em lâminas que foram previamente fixados em formalina, embebidos em parafina e corados com HE (artigo 3). Essa metodologia permitiu detectar a presença de F. hepatica em L. viatrix através da Multiplex-PCR, que mostrou ser um método rápido, seguro e específico, altamente sensível capaz de amplificar DNA de tecidos fixados, a despeito da baixa quantidade de DNA e da degradação causada pelo processo de fixação, possibilitando detecção da presença da F. hepatica mesmo em lâminas onde não era possível observar estágios larvais desse trematódeo através da análise sob microscópio óptico. Dessa forma, as metodologias moleculares, propostas no presente trabalho, para identificação de trematódeos em seus hospedeiros intermediários contribuirão para um avanço em estudos epidemiológicos e de controle da fasciolose e da esquistossomose

Diagnóstico da infecção por trematódeos em moluscos através de Multiplex-PCR / Diagnosis of infection by trematodes in snails by Multiplex-PCR

A Fasciola hepatica têm despertado interesse médico e veterinário nos últimos anos, uma vez que, os casos de fasciolose humana e animal se tornam cada vez mais freqüentes em todo o mundo. Da mesma forma, o S. mansoni continua sendo estudado em decorrência de seu grande impacto sócio-econômico e na saúde pública. O diagnóstico clássico da infecção de S. mansoni em Biomphalaria bem como de F. hepatica em limneídeos é feito rotineiramente em laboratório através de exames dos moluscos após estímulo luminoso (exposição à luz artificial) para observação de cercárias, e/ou dissecando ou esmagando os moluscos, onde além de se observar cercárias também observa-se a presença de rédias (no caso de F. hepatica) e esporocistos, principalmente se estes estiverem localizados na glândula digestiva. Entretanto o encontro de larvas de helmintos em moluscos quase sempre traz resultados inconclusivos, uma vez que existe uma grande semelhança morfológica entre formas intramolusco de trematódeos. No presente trabalho, foi desenvolvido um diagnóstico molecular rápido e eficaz capaz de detectar F. hepatica e S. mansoni em seus hospedeiros intermediários.

Com o intuito de detectar a infecção de S. mansoni e, simultaneamente identificar a espécie de Biomphalaria, utilizamos a Multiplex-PCR para amplificar a região ITS2 dos caramujos e a região do DNAmt desse trematódeo, utilizando simultanemente 6 iniciadores. Esse procedimento permitiu diagnosticar a infecção pelo S. mansoni e realizar a identificação espécie-específica do molusco parasitado, em uma única reação (artigo 1). Para a detectar a infecção de limneídeos por F. hepatica realizamos a Multiplex-PCR, utilizando 4 iniciadores em uma única reação, sob condições de alta estringência, permitindo a amplificação específica do DNA do trematódeo e do molusco (artigo 2). Este método foi altamente sensível, detectando a infecção por até um miracídio de F. hepatica no período pré-patente da infecção, não amplificando DNA de outros trematódeos. Além da especificidade, a Multiplex-PCR também permite o uso de um eficiente controle interno da reação pela amplificação do DNA do molusco. A via migratória e as alterações histopatológicas causadas por helmintos em moluscos têm sido estudadas através de técnicas histológicas.

Diante das dificuldades encontradas em se identificar especificamente a presença de trematódeos em limneídeos através apenas da análise de cortes histológicos sob microscópio de campo claro, padronizamos um método sensível capaz de extrair DNA de cortes histológicos em lâminas que foram previamente fixados em formalina, embebidos em parafina e corados com HE (artigo 3). Essa metodologia permitiu detectar a presença de F. hepatica em L. viatrix através da Multiplex-PCR, que mostrou ser um método rápido, seguro e específico, altamente sensível capaz de amplificar DNA de tecidos fixados, a despeito da baixa quantidade de DNA e da degradação causada pelo processo de fixação, possibilitando detecção da presença da F. hepatica mesmo em lâminas onde não era possível observar estágios larvais desse trematódeo através da análise sob microscópio óptico. Dessa forma, as metodologias moleculares, propostas no presente trabalho, para identificação de trematódeos em seus hospedeiros intermediários contribuirão para um avanço em estudos epidemiológicos e de controle da fasciolose e da esquistossomose.

Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis of the ITS2 region for differatiation of Brazilian Biomphalaria intermediate hosts of the Schistosoma mansoni

O sequenciamento da região espaçadora transcrita interna 2 do DNA ribossomal (ITS2-DNAr) das espécies brasileiras gênero Biomphalaria (B. glabrata, B. tenagophila and B. straminea) hospedeiras intermediárias do Schistosoma mansoni no Brasil, permitiu a análise dos sítios de restrição presentes nestas seqüências. A análise do mapa de restrição obtido dessas seqüências nos permitiu selecionar enzimas mais promissoras que gerassem perfis de restrição capazes de identificar essas espécies. Foram testadas 4 enzimas e a enzima HpaII foi selecionada por produzir perfis espécie específicos de fácil visualização em gel de poliacrilamida. A utilização da região ITS2 tem como vantagens a obtenção de um fragmento pequeno de 460bp, o qual pode ser facilmente amplificado por PCR. Neste trabalho, nos demonstramos que a amplificação da região ITS2-DNAr e a restrição deste com a enzima HpaII é uma ferramenta molecular auxiliar a identificação morfológica desses moluscos, bem como para estudos taxonômicos e filogenéticos de planorbídeos neotropicais.

Detection of Lymnaea columella infection by Fasciola hepatica through Multiplex-PCR

From complete mitochondrial DNA sequence of Fasciola hepatica available in Genbank, specific primers were designed for a conserved and repetitive region of this trematode. A pair of primers was used for diagnosis of infected Lymnaea columella by F. hepatica during the pre-patent period simultaneously with another pair of primers which amplified the internal transcribed spacer (ITS) region of rDNA from L. columella in a single Multiplex-PCR. The amplification generated a ladder band profile specific for F. hepatica. This profile was observed in positive molluscs at different times of infection, including adult worms from the trematode. The Multiplex-PCR technique showed to be a fast and safe tool for fascioliasis diagnosis, enabling the detection of F. hepatica miracidia in L. columella during the pre-patent period and identification of transmission areas.

Aspects of the Maintenance of the Life Cycle of Fasciola hepatica in Lymnaea columella in Minas Gerais, Brazil

Fascioliasis is a parasitic disease of domestic ruminants that occurs worldwide. The lymnaeid intermediate hosts of Fasciola hepatica include Lymnaea columella, which is widely distributed in Brazil. A colony of L. columella from Belo Horizonte, MG, was reared in our laboratory to be used in studies of the F. hepatica life cycle, the intermediate host-parasite relationship and development of an anti-helminthic vaccine. In the first experiment 1,180 snails were exposed to miracidia of F. hepatica eggs removed from the biliary tracts of cattle from the State of Rio Grande do Sul. In the second and third experiments the snails were exposed to miracidia that had emerged from F. hepatica eggs from Uruguay, maintained in rabbits. The rates of infection in the first, second and third experiments were 0, 42.1 and 0 percent respectively. Over 15,806 metacercariae were obtained and stored at 4ºC. Four rabbits weighing 1.5 kg each were infected with 32-44 metacercariae and two with 200. Three rabbits begin to eliminate eggs of the parasite in the feces from 84 days after infection onwards. The biological cycle of F. hepatica in L. columella and the rabbit was completed within 124 days

Rearing of Lymnaea columella (Say, 1817), intermediate host of Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758)

The intermediate host of Fasciola hepatica, Lymnaea columella, collected in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, was reared in our laboratory. The aim of the current study was to standardize a rearing and maintenance technique. Two kinds of diet were tested: fresh lettuce (A) and rodent ration + 10 percent CaCO3 plus fresh lettuce (B). The age for the beginning of oviposition ranged from 27 to 57 days. Ten days after oviposition at 24.7§C, 100 percent eclosion occurred. The complete life cycle varied from 37 to 67 days. The average numbers of eggs per egg mass were 26.3 and 31.1 with diets (A) and (B), respectively. The lettuce and ration fed snails presented a increased growth although the difference was not statistically significant (p > 0.05). The mortality rate varied from 40 to 64 percent after 90 days. The maximum longevity was 183 days, 21.5 mm length and 11 mm wide. The methodology to mass breed and maintain these snails was found to be suitable in the laboratory.