Apoptose e expressão de Bcl-2 e das caspases 3 e 8 em placenta bovina, em diferentes estádios de gestação / Apoptosis and expression of Bcl-2 and caspases 3 and 8 in placenta of cows at different pregnancy stages

Apoptose e seus mecanismos reguladores são eventos fisiológicos cruciais para a manutenção da homeostase placentária, e o desequilíbrio desses processos pode comprometer a função placentária e, consequentemente, o sucesso da gravidez. Neste estudo, investigou-se a apoptose utilizando-se histomorfometria em lâminas coradas em HE e submetidas à reação de TUNEL. Além disso, avaliou-se a expressão de Bcl-2 e das caspases 8 e 3, pela reação de polimerase em cadeia em tempo real, em placentas saudáveis em diferentes estádios de gestação. Amostras de placentônios de vacas com quatro, seis e nove meses de gestação foram colhidas e processadas. O índice apoptótico aumentou progressivamente com o avanço da gestação. Tanto o Bcl-2 quanto as caspases 3 e 8 foram expressas nos três períodos estudados, sendo a expressão de Bcl-2 menor que a de caspase 8, que é menor que a de caspase 3. Estes resultados indicam que essas moléculas estão envolvidas na via apoptótica ativada na maturação placentária, exibindo um padrão de expressão ao longo da gestação e contribuindo para o equilíbrio fisiológico da celularidade e renovação celular na placenta bovina.

Apoptosis and its regulating mechanisms are crucial physiological events for the maintenance of the placental homostasis; and disequilibrium of these processes may compromise placental function and the success of the pregnancy. In this study, apoptosis was investigated by histomorphometry using slides stained with HE and TUNEL reaction. Besides that, Bcl-2 and caspases 8 and 3 expression were evaluated by real time polymerase chain reaction in healthy placentas under different gestacional ages. Samples of placentones of cows at 4th, 6th, and 9th months of gestation were harvested and processed. The apoptotic index gradually increased with the advance of the gestation. Bcl-2 and caspases 3 and 8 were expressed in all the studied periods, being the expression of Bcl-2 lower than that of caspase 8, which was lower than caspase 3. These results indicate that these molecules are involved in the activated apoptotic way in the placental maturation, showing a standard expression throughout the gestation and contributing for the physiological balance of the cellularity and cellular turn over in bovine placenta.

Apoptosis in the transplanted canine transmissible venereal tumor during growth and regression phases / Apoptose no tumor venéreo transmissível canino durante as fases de crescimento e regressão

Twelve male, mongrel, adult dogs were subcutaneously transplanted with cells originated from two canine transmissible venereal tumors (TVT). The aim was to demonstrate and to quantify the occurrence of apoptosis in the TVT regression. After six months of transplantation, a tumor sample was obtained from each dog, being six dogs with TVT in the growing phase and six in the regression phase as verified by daily measurements. Samples were processed for histological and ultrastructural purposes as well as for DNA extraction. Sections of 4µm were stained by HE, Shorr, methyl green pyronine, Van Gieson, TUNEL reaction and immunostained for P53. The Shorr stained sections went through morphometry that demonstrated an increase of the apoptotic cells per field in the regressive tumors. It was also confirmed by transmission electron microscopy, which showed cells with typical morphology of apoptosis and by the TUNEL reaction that detected in situ the 3'OH nick end labeling mainly in the regressive tumors. The regressive TVTs also showed an intensified immunostaining for P53 besides a more intense genomic DNA fragmentation detected by the agarose gel electrophoresis. In conclusion, apoptosis has an important role in the regression of the experimental TVT in a way that is P53-dependent.

Doze cães, adultos, machos e sem raça definida foram transplantados subcutaneamente, na região hipogástrica, com células originadas de dois tumores venéreos transmissíveis caninos (TVT). O objetivo do estudo foi demonstrar e quantificar a ocorrência de apoptose na regressão do TVT. Após seis meses, foi obtido um tumor de cada animal, totalizando seis em crescimento e seis em regressão. Fragmentos dos tumores foram processados para avaliação histológica, ultra-estrutural e também para extração de DNA. Cortes de 4µm foram corados em HE, Shorr, verde de metila pironina e Van Gieson e alguns foram submetidos à reação do TUNEL e à imunoistoquímica para P53. Secções coradas pelo Shorr, submetidas à morfometria, demonstram maior índice apoptótico nos tumores em regressão. Esse achado foi confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão que evidenciou células com morfologia típica de apoptose e pela reação de TUNEL que marcou mais células nos tumores em regressão que naqueles em crescimento. A imunomarcação para P53 foi mais intensa nos tumores em regressão, assim como a fragmentação internucleossômica do genoma mostrada pela eletroforese em gel de agarose. Concluiu-se que a apoptose tem importante papel na regressão do TVT transplantado experimentalmente, sendo, nesse caso, dependente de P53 para a sua execução.

Apoptose e expressão de VP2 e GAPDH na infecção precoce pelo vírus da doença infecciosa da bursa de Fabricius em pintos SPF / Apoptosis and expression of VP2 and GADPH in an experimental infectious bursal disease in SPF chicks

Vinte e nove pintos SPF de um dia foram inoculados com o vírus da doença infecciosa da bursa de Fabricius (VDIB) para avaliar a ocorrência precoce de apoptose e a expressão da proteína viral 2 (VP2) e da enzima gliceraldeído fosfato dehidrogenase (GAPDH). Os animais foram distribuídos em cinco grupos: 1-controle; e 2 a 5- com 24, 48, 72 e 96 horas pós-inoculação, respectivamente. Fragmentos da bursa de Fabricius foram colhidos para processamento histológico e extração de RNA. Lâminas coradas em HE e TUNEL (marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de deoxinucleotídeo) foram utilizadas na morfometria do índice apoptótico. Amostras de mRNA foram testadas para a expressão dos genes VP2 e GAPDH utilizando-se transcrição reversa e RT-PCR. Utilizou-se um kit SYBR GREEN PCR, e a reação foi desenvolvida em ABI Prism 7000 SDS. Os índices apoptóticos cresceram progressivamente indicando uma relação na atrofia bursal causada pelo VDIB. Paralelamente, os resultados da PCR em tempo real demonstraram queda da carga viral nas células linfóides da bursa nos diferentes intervalos de tempo do experimento. Esses resultados sugerem um papel protetor da apoptose na diminuição da replicação viral.

Twenty-nine SPF 1-day-old chicks were inoculated with infectious bursal disease virus (IBDV) to evaluate early apoptosis and the expression of viral protein 2 (VP2) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease (GAPDH). Five groups were formed: G1-control -and G2 to G5, - 24, 48, 72 and 96 hours post inoculation, respectively. Half of each BF was fixed and processed by routine techniques. To quantify apoptosis, 5µm-thick sections were stained with HE and submitted to TUNEL (terminal transferase UDP nick end labeling) technique. mRNA was extracted from pooled samples of 3 animals/group and used for the expression of VP2 and GADPH genes using the reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). A SYBR GREEN PCR kit was used and the reaction was carried out in an ABI Prism 7000 SDS. Apoptotic indexes progressively increased indicating a role of IBDV in inducing hypotrophy of the BF. Also, it was showed that as long as apoptosis increased, viral protein expression decreased, which suggests that apoptosis plays a role as a defense mechanism against viral replication.

Morphometric analysis of the thymus of puppies infected with the Snyder Hill Strain of canine distemper virus / Análise morfométrica do timo de cães filhotes infectados com a amostra Snyder Hill do vírus de cinomose canina

The thymic morphometry analysis was used for determining apoptosis and atrophy of the thymus of eight puppies inoculated with canine distemper virus (CDV). Three healthy dogs were used as negative controls. Sections, 5æm thick, were stained by HE and Shorr, and the latter were evaluated by morphometry. CDV nucleoprotein was detected by immunohistochemistry. Morphometric results confirmed lymphoid hypotrophy in CDV inoculated dog thymuses, more stroma, less parenchyma and higher apoptotic index/field than negative control (not inoculated) puppies. Apoptosis plays a role in the mechanism of thymus atrophy that develops in canine distemper.

Determinaram-se a apoptose e a atrofia no timo de oito cães novos, inoculados experimentalmente com o vírus de cinomose. Três cães saudáveis foram usados como controle negativo. Secções coradas pelo Shorr foram avaliadas por morfometria. A nucleoproteína viral foi detectada por imunoistoquímica. Os resultados morfométricos confirmaram a hipotrofia e mostraram que o timo dos cães inoculados tinha mais estroma, menos parênquima e maior índice apoptótico/campo que o dos animais-controle. Pode-se concluir que a apoptose desempenha importante papel no mecanismo de hipotrofia tímica que se desenvolve na cinomose.

Expressão gênica de caspases 3 e 8 em timo e baço de ratas recém-desmamadas e imunossuprimidas por glicocorticóide / Genic expression of caspases 3 and 8 in thymus and spleen of glicocorticoid-immunossupressed weaned rats

Determinou-se a expressão gênica das caspases 3 e 8 mediante transcrição reversa de mRNA total e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para avaliar a apoptose em timo e baço de ratas imunossuprimidas por glicocorticóides. Utilizou-se dexametasona para indução da apoptose e atrofia linfóide. Quarenta e cinco fêmeas Wistar recém-desmamadas foram separadas em três grupos: as ratas de A (n=18) e B (n=18) foram tratadas com 250 e 500mg de glicocorticóide, via intramuscular, respectivamente, e as do C (n=9) não foram tratadas. Após 24, 48 e 72 horas, seis animais de cada grupo tratado e três do controle foram anestesiados, pesados e sacrificados. O baço e o timo foram coletados e pesados. Fragmentos dos órgãos foram fixados em formol tamponado a 10 por cento e processados segundo técnica para inclusão em parafina. Os blocos foram seccionados em 5æm, e os cortes corados em hematoxilina e eosina. A análise histopatológica aliada ao peso dos órgãos nas diferentes doses e tempos demonstrou que a dexametasona induziu hipotrofia linfóide, que ocorreu com maior intensidade no tempo de 72 horas em animais do grupo B. Fragmentos de timo e de baço foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido para extração de mRNA e DNA. Para a padronização da técnica de RT-PCR, utilizaram-se pool de amostras de mRNA dos animais-controle e pool de mRNA de animais tratados em cada tempo de experimento. A técnica de RT-PCR foi sensível o suficiente para a detecção dos mRNAs que codificam as caspases 3 e 8, e ambas participaram do processo de apoptose induzido por dexametasona.

Etoposide-induced apoptosis in murine neuroblastoma (N2A) cells infected with Paramyxoviruses

O presente trabalho foi realizado tendo como objetivo determinar se o vírus de sarampo induz apoptose em células de neuroblastoma murino e avaliar o comportamento de células de neuroblastoma murino agudamente infectadas com vírus do sarampo ou persistentemente infectadas com o vírus da cinomose canina quando tratadas com etoposídeo. A infecção pelo vírus de sarampo induziu principalmente necrose em células de neuroblastoma murino. A infecção persistente pelo vírus de cinomose canina não alterou o comportamento de células de neuroblastoma murino tratadas com etoposídeo

Experimental myocardial hypertrophy induced by a minimally invasive ascending aorta coarctation

Ascending aorta coarctation was produced by a minimally invasive technique in rabbits. Animal mortality was 5 percent. Morphometric and hemodynamic parameters were evaluated. A parabiotically isolated heart model was used to assess the hemodynamic parameters. Left ventricular weight/body weight ratio and muscle area showed clear evidence of hypertrophy when compared to control. The hemodynamic changes in the isolated heart model suggested decreased diastolic and systolic function in the coarcted group. The present model produced hypertrophy with low mortality rates as a result of its less invasive nature

Detecçäo de DNA de herpesvírus eqüino-1 em embriäo e em sêmen eqüino por meio de PCR / Detection of equine herpesvirus 1 DNA in a single embryo and in horses semen by polymerase chain reaction

O genoma das amostras de um embriäo e sêmen de três eqüinos, coletados em uma fazenda brasileira, foram testados para a presença de seqüências específicas dos genes da timidina kinase (TK) de herpesvírus eqüino-1 (HVE-1) e herpesvírus eqüino-4 (HVE-4) por meio de reaçäo em cadeia da polimerase (PCR). A PCR detectou sequências específicas do gene de TK de HVE-1 em todas as amostras testadas. O DNA template extraído de leucócitos periféricos da égua doadora do embriäo também foi amplificado pelos pares de primers designados para TK do HVE-1. Vírus infeccioso näo foi isolado desses espécimes. Os resultados indicaram que o PCR foi mais sensível do que o método de isolamento em cultura de células para a detecçäo do HVE-1 em sêmen de cavalos portadores

Detecçäo do vírus da hepatite murina utilizando-se a reaçäo em cadeia pela polimerase / Detection of mouse hepatitis virus in mouse colonies using the nested polymerase chain reaction

Desenvolveu-se a técnica de transcriçäo reversa - reaçäo em cadeia pela polimerase para detectar o vírus da hepatite do camundongo em tecido hepático. Para se eliminar possíveis falhas na reaçäo de amplificaçäo RT-PCR usou-se um segundo ciclo de amplificaçäo com primers internos para confirmar a especificidade e aumentar a sensibilidade do teste. Após a optimizaçäo do protocolo, descreve-se a detecçäo da amplificaçäo específica da seqüência-alvo em camundongos de 18 das 20 colônias examinadas

Uso de um sistema de ELISA para detecçäo de anticorpos contra herpesvírus eqüino 1 (HVE-1) em éguas gestantes assintomáticas e potros recém-nascidos / Use of an ELISA system for detection of equine herpesvirus 1 (EHV-1) antibodies in non-symptomatic pregnant mares and neonatal foals

Um sistema de ELISA foi utilizado para se estudar a prevalência do herpesvirus eqüino 1 (HVE-1) em plantéis de cavalos brasileiros vacinados e näo vacinados. Amostras de soros foram coletadas de éguas gestantes assintomáticas, antes e após o parto e de seus respectivos potros recém-nascidos. O antígeno foi preparado de uma fraçäo viral purificada (HVE-1 amostra Ab1). O ponto de corte (absorvância de 0,3516) foi determinado considerando o limite máximo para os valores negativos. Esse valor determinou sensibilidade de 100 por cento e especificidade de 94,7 por cento, utilizando um banco de soros de éguas gestantes e fetos. No estudo observou-se alta correlaçäo entre o ELISA e a soro-neutralizaçäo para detecçäo de anticorpos específicos contra o EHV-1

Detecçäo de amostras brasileiras do herpesvirus bovino 1 (BHV-1) pela reaçäo em cadeia pela polimerase / Detection of different Brazilian strains of the bovine herpesvirus-1 (BHV-1) by polymerase chain reaction

A técnica da reaçäo em cadeia pela DNA polimerase (PCR) foi usada para a amplificaçäo rápida de um fragmento de 456bp da regiäo única curta (Us) do genoma do BHV-1. Iniciadores de 18pb do gene da ORF1 foram usados para a amplificaçäo das amostras-padräo e brasileiras. Uma amplificaçäo clássica näo foi bem sucedida. A amplificaçäo foi obtida quando se escolheu uma regiäo com baixa concentraçäo de GC no DNA do BHV-1 e através da desnaturaçäo térmica (95§C para 5min) seguida de ciclos térmicos (94§C por 1min e 30seg; 52§C por 1min; 72§C por 1min e 30 seg; e ainda por 35 ciclos de 94§C por 1min; 52§C por 1min; 72§C por 1min e 30 seg; usando um tempo de extensäo final de 72§C por 5min). A clivagem com Pst I confirmou a especificidade do fragmento da ORF 1 do BHV-1. A amplificaçäo do fragmento em todas as amostras testadas sugere que a regiäo é fortemente conservada no genoma do BHV-1. Este PCR poderá detectar rapidamente amostras clínicas, sendo sensível e específico para diagnosticar infecçöes pelo BHV-1

Presença de "Linha Morgan" como indicador de displasia coxofemoral em cäes da raça Pastor-Alemäo / Presence of Morgan-Line as an indicator of canine hip dysplasia in German Shepherd dogs

The aim of this study, was to determine the relationship between the presence of Morgan line and hip dysplasia. From June, 1986 to October, 1993, 190 X-ray plates of German Shepherd dogs, from both sexes were collected and analyzed. The results showed that out of the 190 dogs evaluated, 136 (71.6 per cent) had hip dysplasia, 43 (22.6 per cent) presented Morgan line and 41 (21.5 per cent) showed both of them. Just two (1.1 per cent) dogs presented Morgan line without hip dysplasia. No statistically significant difference was found between males (21.8 per cent) and females (23.3 per cent). From this study it can be concluded that the presence of the Morgan line can be considered indicative to hip dysplasia diagnosis, even though the absence of the line does not exclude the possibility of hip dysplasia

Presença de "Linha Morgan" como indicador de displasia coxofemoral em cães da raça Pastor-Alemão

The aim of this study was to determine the relationship between the presence of Morgan line and hip dysplasia. From June, 1986 to October, 1993, 190 X-ray plates of German Shepherd dogs, from both sexes were collected and analyzed. The results showed that out of the 190 dogs evaluated, 136 (71.6%) had hip dysplasia, 43 (22.6%) presented Morgan line and 41 (21.5%) showed both of them. Just two (1.1%) dogs presented Morgan line without hip dysplasia. No statistically significant difference was found between males (21.8%) and females (23.3%). From this study it can be concluded that the presence of the Morgan line can be considered indicative to hip dysplasia diagnosis, even though the absence of the line does not exclude the possibility of hip dysplasia.

Freqüência de displasia coxofemural em cäes da raça Rottweiler em Minas Gerais / Frequency of hip dysplasia in Rottweiler dogs in Minas Gerais, Brazil

Sixty X-rays of Rottweiler dogs, males and females, obtained between March 1992 and April 1994, were studied with the purpose of establishing the frequency of hip dysplasia. The X-rays were taken with the animals in the ventrodorsal position, with the limbs parallel and the pelvis symmetric. The study indicated that 31.67 por cento of animals were carrier of hip dysplasia in differents grades