Caracterización del perfil quimiosensibilidad y del estado de ampliación génica de un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar / Characterization of chemosensitivity profile gene amplification status of a panel of lung cancer cell lines

En este trabajo se presentan los resultados de un análisis de amplificación génica y de sensibilidad a fármacos antineoplásicos, realizado para un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar. Para los ensayos de quimiosensibilidad las células fueron tratadas durante 48 h con concentraciones variables de taxol, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluoracilo. La citotoxicidad de los fármacos se cuantificó usando el ensayo de reducción de resazurina y se reportó en valores de concentración inhibitoria 50 (CI50). Para los análisis de amplificación génica se emplearon sondas TaqMan® dirigidas contra los genes AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, c-REL y genes de la familia MYC. El número de copias para cada gen fue calculado usando el método de doble delta Ct, empleando ACTB como gen de referencia y la línea MRC-5 como muestra control. Los resultados mostraron que la viabilidad de todas las líneas celulares se afectó por el tratamiento con taxol, cisplatino y doxorrubicina, pero no con el tratamiento con 5-fluoracilo. Las CI50 calculadas se ubicaron entre 0,38 ± 0,03 µM y 111,3 ± 3,58 µM, siendo el taxol y la doxorrubicina los fármacos más potentes. Del panel evaluado las células NCI-H292 resultaron ser las más sensibles y las células LSPG8G las más resistentes a los fármacos. Interesantemente en las células NCI-H292 ningún gen se encontró amplificado; por el contrario en las células LSPG8G los genes cMYC, MYCN, MYCL y AKT2 mostraron un aumento en el número de copias con respecto al de las células control. Estos resultados sugieren que eventos de amplificación génica podrían contribuir con el fenómeno de quimioresistencia en líneas celulares de cáncer de pulmón, sin embargo otros estudios deben realizarse para confirmar esta hipótesis.

In this paper, we show results of anticancer drug sensitivity assays and studies of gen amplification performed for a panel of lung cancer cell lines. For the chemosensitivity assays the cells were treated for 48 h with different concentrations of taxol, cisplatin, doxorubicin and 5-fluorouracil. The cytotoxic effect of each drug was determined using the resazurin reduction assay and reported in terms of inhibitory concentration 50 (IC50). For the analysis of gene amplification we used TaqMan® probes designed against AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, REL and MYC family members. Copy number for each gene was calculated using the delta-delta-CT method, employing ACTB as reference gen and MRC-5 cell line as control sample. In the chemosensitivity assays, we observed a clear decrease in cell viability in the cells treated with taxol, cisplatin and doxorubicin but not in the cells treated with 5-fluorouracil. IC50 values ranging between 0,38± 0,03 µM and 111,3 ±3,58 µM, being the taxol and doxorubicin the most potent drugs. NCI-H292 cell line was the most sensitivity and LSPG8G cell line was the most resistant. Interestingly, NCI-H292 cells did not show increase in the copy numbers for the gene evaluated, in contrast, we observed changes in the gene dosage for cMYC, MYCN, MYCL and AKT2 in LSPG8G cells. These results suggest that gene amplification could contribute to drug resistance in lung cancer cell lines; however, more studies are needed to confirm this hypothesis.

Development and validation of a TaqMan multiplex PCR assay for the Gene Dosage Quantification in cancer / Desarrollo y validación de PCR múltiplex con sondas TaqMan para la cuantificación de la dosis génica en cáncer

Gene dosage tests are very important for the molecular diagnosis of diseases caused by either deletion or amplification of a specific DNA region containing certain genes. Changes in gene copy number may lead to under- or over expression of genes responsible for the disease phenotype. Discovering these defects and understanding their biological meaning can lead to improved therapeutic opportunities in cancer. Fluorescent in situ hybridization (FISH) still remains the gold standard method for gene dosage analysis. However have several limitations since locus specific probes are expensive, the procedure is significantly time-consuming and tandem microduplications may be undetected as a result of the limited resolution on metaphase spreads. Quantitative Real-time PCR is a rapid assay with results available in 24h, has advantages in terms of sensitivity and specificity. In the present study, we have developed an assay using TaqManTM multiplex Real-time PCR for gene dosage analysis of oncogenes EGFR, ERBB2, AKT2, CMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA and REL in human cell lines. This method calculates the copy number of each oncogen and is a promising alternative technique to FISH and Southern blot. Therefore, this technique could be considered as a powerful method gene dosage quantitation in clinical and research genetic surveys.

La evaluación de la dosis génica constituye una herramienta importante para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas tanto por la pérdida o amplificación de una región específica de ADN. El cambio en el número de copias génicas, puede conllevar a la pérdida o sobreexpresión de los genes responsables de fenotipo de la enfermedad. El descubrimiento de estas alteraciones y la comprensión de su significado biológico pueden conducir al incremento de las oportunidades terapéuticas en cáncer. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es el método de referencia para el análisis de la dosis génica “amplificación”. Sin embargo, presenta algunas limitaciones relacionadas con el costo de las sondas locus específicas; el procedimiento es demorado y las microduplicaciones en tándem podrían no ser detectadas como resultado de la limitada resolución de las metafases. En este sentido, la PCR cuantitativa es una metodología rápida y tiene ventajas en términos de sensibilidad y especificidad. En el presente estudio, se estandarizó la PCR multiplex en tiempo real para el análisis de la dosis génica de los oncogenes EGFR, ErbB2, AKT2, cMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA y REL en líneas celulares tumorales humanas, como una técnica alternativa al FISH para evaluar la dosis génica en muestras clínicas de cáncer.

Caracterización del perfil de sensibilidad de un panel de líneas celulares para valoración de citotoxicidad in vitro / Sensitivity profile of a panel of cell lines designed for the evaluation of in vitro cytotoxicity

Introducción. La valoración de la citotoxicidad in vitro de líneas celulares derivadas de tumores humanos se emplea como bioensayo preliminar para el tamizaje de productos de origen natural con potencial actividad anticancerígena. Objetivo. Fortalecer el modelo de valoración de citotoxicidad in vitro disponible en el laboratorio, ampliando el panel de líneas celulares y caracterizando su perfil de sensibilidad a los fármacos antineoplásicos. Materiales y métodos. Se adicionaron al panel las líneas celulares HeLa, MKN-45 y U-937, y se evaluó la sensibilidad de las siete líneas celulares (HEp-2, HT-29, MCF-7, SiHa, MKN-45, HeLa y U-937) a los fármacos antineoplásicos doxorrubicina HCl, taxol, cisplatino, ciclofosfamida y carmustina, usados en la terapia antineoplásica. Para la valoración de la citotoxicidad se empleó el método de reducción del metil-tiazol-tetrazolio. Resultados. Al comparar las concentraciones letales 50 (CL50) calculadas, se evidenció una sensibilidad diferencial de las líneas celulares frente a doxorrubicina HCl, taxol y cisplatino, siendo HEp-2 la línea más sensible a todos los fármacos, en tanto que las HeLa y U-937 fueron las más resistentes. La respuesta de HEp-2 frente al taxol presentó un comportamiento bifásico, relacionado con su mecanismo de acción. Conclusión. En las condiciones empleadas no se observaron efectos frente a la ciclofosfamida y la carmustina.