Contributions and difficulties of soil metagenomics and its impact on agricultura / Aportes y dificultades de la metagenómica de suelos y su impacto en la agricultura

RESUMEN Los microorganismos son de gran interés porque colonizan todo tipo de ambiente, sin embargo, uno de los problemas al que nos enfrentamos para conocer su diversidad biológica es que no todos los microorganismos son cultivables. El desarrollo de nuevas tecnologías como la generación de vectores de clonación aunado al desarrollo de técnicas de secuenciación de alto rendimiento ha favorecido el surgimiento de una nueva herramienta llamada metagenómica, la cual nos permite estudiar genomas de comunidades enteras de microorganismos. Debido a que ningún ambiente es idéntico a otro, es importante mencionar que dependiendo del tipo de muestra a analizar será el tipo de reto al cual nos enfrentaremos al trabajar con metagenómica, en el caso específico del suelo existen diversas variantes como la contaminación del suelo con metales pesados o diversos compuestos químicos que podrían limitar los estudios. Sin embargo, pese a las limitaciones que el mismo ambiente presenta, la metagenómica ha permitido tanto el descubrimiento de nuevos genes como la caracterización de las comunidades microbianas que influyen positivamente en el desarrollo de plantas, lo cual en un futuro podría generar un gran impacto en la agricultura. En este artículo se realizó una revisión de diversas investigaciones que han empleado metagenómica, reportadas en las bases de datos de PudMed y Google Schoolar, con el objetivo de examinar los beneficios y limitaciones de las diversas metodologías empleadas en el tratamiento del ADN metagenómico de suelo y el impacto de la metagenómica en la agricultura.

ABSTRACT Microorganisms are of great interest because they colonize all types of environment, however, one of the problems we face in knowing biological diversity is that not all microorganisms are cultivable. The development of new technologies such as the generation of cloning vectors coupled with the development of high performance sequencing techniques, have favored the emergence of a new tool in science called metagenomics, which allows us to study genomes of entire communities. Since all environments are different, the type of challenge that we will face when working with metagenomics is going to change depending of the type of sample, in the specific case of soils, there are several variables, such as soil contamination with heavy metals or chemical compounds that could limit metagenomic studies. However, despite the limitations that the environment presents, with the help of metagenomics, both gene discovery and the characterization of microbial communities that positively influence plant development have been achieved, which could generate a greater impact on agriculture in the future. In this article a review of several investigations that have used metagenomics, reported in the PudMed and Google Schoolar databases was carried out, with the aim of examining the benefits and limitations of the various methodologies used in the treatment of metagenomic DNA from soil and the impact of metagenomics in agriculture.

Importancia de compuestos antimicrobianos producidos por bacterias benéficas en el biocontrol de fitopatógenos / The importance of antimicrobial compounds produced by beneficial bacteria on the biocontrol of phytopathogens

ABSTRACT Bacteria produce antimicrobial compounds to compete for nutrients and space in a particular habitat. Antagonistic interactions can be evaluated by several methodologies including the double-layer agar and simultaneous inhibition assays. Among the well-known inhibitory substances produced by bacteria are the broad-spectrum antibiotics, organic acids, siderophores, antifungal, and bacteriocins. The most studied bacterial genera able to produce these inhibitory substances are Enterococcus, Lactococcus, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Escherichia, and Burkholderia. Some beneficial bacteria can promote plant growth and degrade toxic compounds in the environment representing an attractive solution to diverse issues in agriculture and soil pollution, particularly in fields with damaged soils where pesticides and fertilizers have been indiscriminately used. Beneficial bacteria may increase plant health by inhibiting pathogenic microorganisms; some examples include Gluconacetobacter diazotrophicus, Azospirullum brasilense, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas protegens, and Burkholderia tropica. However, most studies showing the antagonistic potential of these bacteria have been performed in vitro, and just a few of them have been evaluated in association with plants. Several inhibitory substances involved in pathogen antagonism have not been elucidated yet; in fact, we know only 1 % of the bacterial diversity in a natural environment leading us to assume that many other inhibitory substances remain unexplored. In this review, we will describe the characteristics of some antimicrobial compounds produced by beneficial bacteria, the principal methodologies performed to evaluate their production, modes of action, and their importance for biotechnological purposes.

RESUMEN Las bacterias producen compuestos antimicrobianos para competir por nutrientes y espacio en un hábitat particular. Las interacciones antagónicas pueden evaluarse mediante varias metodologías, incluido el agar de doble capa y los ensayos de inhibición simultánea. Las sustancias inhibidoras mejor conocidas producidas por bacterias incluyen antibióticos, ácidos orgánicos, sideróforos, antifúngicos y bacteriocinas. Entre los géneros bacterianos más estudiados que producen sustancias inhibidoras se incluyen Enterococcus, Lactococcus, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Escherichia y Burkholderia. Algunas bacterias beneficiosas tienen la capacidad de promover el crecimiento de las plantas y degradar compuestos tóxicos en el ambiente, por lo que podrían incrementar el rendimiento de los cultivos y disminuir problemas de contaminación del suelo, especialmente donde los pesticidas y fertilizantes han sido utilizados indiscriminadamente. Algunas bacterias beneficiosas pueden aumentar la salud de las plantas al inhibir microorganismos patógenos, por ejemplo, Gluconacetobacter diazotrophicus, Azospirullum brasilense, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas protegens y Burkholderia tropica. Sin embargo, la mayoría de los estudios que muestran el potencial antagónico de estas bacterias se han realizado in vitro, y pocos de ellos se han evaluado en asociación con plantas. Varias sustancias inhibitorias implicadas en el antagonismo de los patógenos aún son desconocidas; de hecho, sabemos que solo se ha aislado el 1 % de la diversidad bacteriana en un ambiente natural, lo que sugiere que hay muchas otras sustancias inhibitorias que no han sido exploradas. En esta revisión describimos las características de algunos compuestos antimicrobianos producidos por bacterias beneficiosas, las principales metodologías usadas para evaluar su producción, modos de acción y su importancia para fines biotecnológicos.

La disminución de la población de Gluconacetobacter diazotrophicus en caña de azúcar, después de la fertilización nitrogenada, está relacionada con la fisiología de las plantas en experimentos de raíz dividida / The decrease in the population of Gluconacetobacter diazotrophicus in sugarcane after nitrogen fertilization is related to plant physiology in split root experiments

It has been established that a decrease in the population of Gluconacetobacter diazotrophicus associated with sugarcane occurs after nitrogen fertilization. This fact could be due to a direct influence of NH4NO3 on bacterial cells or to changes in plant physiology after fertilizer addition, affecting bacterial establishment. In this work, we observed that survival of G. diazotrophicus was directly influenced when 44.8 mM of NH4NO3 (640 mg N/plant) was used for in vitro experiments. Furthermore, micropropagated sugarcane plantlets were inoculated with G. diazotrophicus and used for split root experiments, in which both ends of the system were fertilized with a basal level of NH4NO3 (0.35 mM; 10 mg N/plant). Twenty days post inoculation (dpi) one half of the plants were fertilized with a high dose of NH4NO3 (6.3 mM; 180 mg N/plant) on one end of the system. This nitrogen level was lower than that directly affecting G. diazotrophicus cells; however, it caused a decrease in the bacterial population in comparison with control plants fertilized with basal nitrogen levels. The decrease in the population of G. diazotrophicus was higher in pots fertilized with a basal nitrogen level when compared with the corresponding end supplied with high levels of NH4NO3 (100 dpi; 80 days post fertilization) of the same plant system. These observations suggest that the high nitrogen level added to the plants induce systemic physiological changes that affect the establishment of G. diazotrophicus.

La población de Gluconacetobacter diazotrophicus asociada a la caña de azúcar disminuye después de la fertilización nitrogenada, lo cual podría ocurrir por la influencia directa del NH4NO3 sobre la supervivencia bacteriana, o por cambios en la fisiología de las plantas, que impiden el establecimiento bacteriano. En el presente trabajo se observó que en experimentos in vitro la supervivencia de G. diazotrophicus fue influenciada por 44,8 mM de NH4NO3 (640 mg N/plant). Además, G. diazotrophicus fue inoculado en plántulas micropropagadas de caña de azúcar, que fueron usadas para realizar experimentos de raíz dividida, en las que ambos extremos de los sistemas se fertilizaron con un nivel basal de NH4NO3 (0,35 mM; 10 mg N/planta). A los 20 días posteriores a la inoculación (dpi), la mitad de plantas fueron fertilizadas en uno de sus extremos con una dosis elevada de NH4NO3 (6,3 mM; 180 mg of N/plant). Este nivel fue menor al que afectó directamente a las células de G. diazotrophicus; sin embargo, provocó una disminución de la población bacteriana en comparación con plantas testigo fertilizadas con niveles basales de nitrógeno. La disminución de la población fue mayor para raíces fertilizadas con un nivel basal de nitrógeno en comparación con las raíces fertilizadas con altos niveles del mismo sistema de plantas (100 dpi; 80 días posfertilización). Estas observaciones indican que el alto nivel de nitrógeno añadido a las plantas inducen cambios fisiológicos sistémicos que afectan el establecimiento de G. diazotrophicus.

Cuantificación de bacterias cultivables mediante el método de Goteo en Placa por Sellado (o estampado) Masivo / Quantification of cultivable bacteria by the Massive Stamping Drop Plate method

Cuando se desea cuantificar el número de bacterias presentes en múltiples muestras, los procedimientos de rutina suelen consumir mucho tiempo. En ese periodo las muestras podrían sufrir modificaciones en su población. En el presente trabajo se evaluó una metodología alternativa para cuantificar bacterias cultivables de forma masiva, rápida y económica en la que se implica el sellado, estampado o impresión de diluciones seriadas de muestras de diversa procedencia. El tiempo requerido para preparar 22 muestras para su sellado en placa es de 15 minutos. El método se basó en realizar diluciones seriadas (base 10) de las muestras líquidas originales contenidas en una placa multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal. Después, con un replicador se tomó un volumen (aproximadamente 1,65 µl) de muestra de cada pozo, que se inoculó por sellado en un medio de crecimiento gelificado de interés. Las placas se incubaron el tiempo necesario, se contó el número de colonias presentes en la dilución contable y se calculó el número de Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/ml) para cada muestra. La metodología se denominó "Goteo por Sellado en Placa Masivo" (GSPM) y ha sido aplicada para cuantificar exitosamente bacterias provenientes de diferentes muestras de laboratorio, por ejemplo, de cultivos líquidos, muestras clínicas (como exudados y secreciones) y bacterias presentes en la rizósfera de plantas de maíz. Sin embargo, la metodología GSPM podría aplicarse para contabilizar masivamente a bacterias de cualquier otra procedencia.

In an attempt to quantify the number of bacteria present in a high number of samples, routine procedures are usually very time-consuming. During this period of time, bacterial population could be modified. In this work, an alternative for a massive, quick and economic method was evaluated in order to count viable bacteria, consisting in the sealing or stamping of serial dilutions performed in samples from different origins. The time required to prepare 22 samples for plate stamping is only 15 minutes. The quantification was based in performing serial dilutions (10-fold) of the original liquid samples contained in a multiwell plate using a multichannel micropipette. Afterwards, using a replicator, the same volume of each sample (approximately 1,65 µl) was recovered from each well, and then it was inoculated and sealed in a solid growth media of interest. Plates were incubated as needed, colonies were counted in the quantifiable dilution and Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) was calculated for each sample. We called this method "Massive Stamping Drop Plate" (MSDP) and it has been successfully applied to count bacteria from different lab samples, including liquid cultures, clinical samples (exudates and secretions) and bacteria recovered from the rhizosphere of corn plants. However, MSDP could also be applied to massively count bacteria from any other source.