Cathepsin B/X is secreted by Echinometra lucunter sea urchin spines, a structure rich in granular cells and toxins

Background Echinometra lucunter is a common American sea urchin responsible for the majority of the marine accidents in Brazil. Although not lethal, these accidents are reported to be extremely painful. Recently, our group described the presence of toxins in its spines that contribute to the pathological reactions. Additionally, we have observed that the E. lucunter spines can regenerate when broken. In the present work we evaluated the enzymatic activities of sea urchin spine extracts in order to identify an enzyme that could contribute not only to the toxicity, but also participate in the spine growth and regeneration. Results The spine aqueous extract was tested for peptidase activity, with synthetic substrates, in the presence and absence of inhibitors and activators. For proper enzyme classification, the FRET-substrate cleavage pattern, pH-dependency activity and Western-blot analyses were performed. The spine extract was able to cleave Z-R-MCA and Abz-GIVRAK(Dnp)-OH following pre-incubation with DTT, and was inhibited by E-64. Furthermore, the double-peaked pH curve (5 and 7) and the cleavage site proportion (4:6, R-A:A-K) indicate the presence of both mono and dicarboxypeptidase activities. Moreover, in Western-blot analysis, the spine extract was positive for anti-cathepsin B antibody. Conclusions E. lucunter spines extracts presented a cysteine peptidase activity that was identified as cathepsin B/X that would participate in the remodeling and growth processes of the spine, as well as in the inflammatory response to the accident.(AU)

Cathepsin B/X is secreted by Echinometra lucunter sea urchin spines, a structure rich in granular cells and toxins

Background Echinometra lucunter is a common American sea urchin responsible for the majority of the marine accidents in Brazil. Although not lethal, these accidents are reported to be extremely painful. Recently, our group described the presence of toxins in its spines that contribute to the pathological reactions. Additionally, we have observed that the E. lucunter spines can regenerate when broken. In the present work we evaluated the enzymatic activities of sea urchin spine extracts in order to identify an enzyme that could contribute not only to the toxicity, but also participate in the spine growth and regeneration. Results The spine aqueous extract was tested for peptidase activity, with synthetic substrates, in the presence and absence of inhibitors and activators. For proper enzyme classification, the FRET-substrate cleavage pattern, pH-dependency activity and Western-blot analyses were performed. The spine extract was able to cleave Z-R-MCA and Abz-GIVRAK(Dnp)-OH following pre-incubation with DTT, and was inhibited by E-64. Furthermore, the double-peaked pH curve (5 and 7) and the cleavage site proportion (4:6, R,A:A,K) indicate the presence of both mono and dicarboxypeptidase activities. Moreover, in Western-blot analysis, the spine extract was positive for anti-cathepsin B antibody. Conclusions E. lucunter spines extracts presented a cysteine peptidase activity that was identified as cathepsin B/X that would participate in the remodeling and growth processes of the spine, as well as in the inflammatory response to the accident.

Evaluation of the genomic DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded oral samples archived for the past 40-years

BACKGROUND: The most common human archival specimens are formalin-fixed, paraffin-embedded tissues (PETs). DNA can be extracted from PETs, but sometimes, it is unsuitable for molecular techniques as slow degradation of DNA occurs with time. OBJECTIVE: The aim of this study was to verify and discuss if samples of oral PETs archived for the past 40-years are possible substrates for molecular biology studies, using PCR. Methods: The samples were submitted to phenol-chloroform extraction method. DNA was qualified and quantified by spectrophotometer analysis, electrophoresis and amplification by PCR. RESULTS: It was observed a weak positive correlation between genomic DNA yield and specimen age. The agarose gel electrophoresis demonstrated that genomic DNA length was more frequently composed of small fragments. The 268-bp fragments of the beta-globin gene was amplified in 55 percent of cases and preferentially in more recent ones, which showed strong amplification if compared with older samples. WAF1 gene with 149-bp presented weak but detectable amplification in 75 percent of cases. The 536-bp fragment of beta-globin gene was detected in 25 percent of samples. The amplification was intense in genomic DNA extracted from recent cases and weak in older ones. CONCLUSION: This study shown that, despite degradation, it is possible to use genomic DNA obtained from PETs, archived for the past forty years, in PCR amplification of small DNA products, being large DNA fragments more difficult to amplificate.

INTRODUÇÃO: O material fixado em formol e embebido em parafina constitui hoje a maior fonte de tecido humano arquivado. O DNA extraído de tecido parafinado por vezes não é adequado para as técnicas de biologia molecular, visto que se apresenta parcialmente degradado. OBJETIVOS: O objetivo desse estudo foi verificar se tecido humano de boca parafinado e arquivado pelos últimos 40 anos pode ser usado para a reação em cadeia da polimerase (PCR). MÉTODOS: Amostras foram submetidas à técnica de extração de DNA pelo método do fenol-clorofórmio. Para quantificação e qualificação do DNA foram realizadas análise em espectrofotômetro, eletroforese em gel de agarose e amplificação pela técnica da PCR. RESULTADOS: Foi observada fraca correlação positiva entre a quantidade de DNA obtida e a idade das amostras. A eletroforese em gel de agarose demonstrou que a maioria do DNA obtido foi constituída de fragmentos pequenos. O fragmento de 268-pb do gene da beta-globina foi amplificado em 55 por cento dos casos, preferencialmente nos casos mais recentes. O fragmento de 149-pb do gene WAF1 apresentou amplificação fraca, mas presente em 75 por cento dos casos. O fragmento de 536-bp do gene da beta-globina foi detectado em somente 25 por cento dos casos e também preferencialmente nos casos mais recentes. CONCLUSÕES: Esse estudo mostrou que, apesar de o DNA estar degradado, é possível usar DNA genômico extraído de tecido parafinado arquivado pelos últimos 40 anos em reações de PCR de produtos pequenos. A amplificação de produtos maiores, entretanto, é mais difícil.

Comparação da expressão imunoistoquímica do p21 com alterações nos exons 2 e 3 do gene waf1 em carcinomas epidermóides de boca / Comparison between immunoexpression of p21 and WAF1 gene alterations in oral squamous cell carcinomas

A proteína p21 é considerada um supressor tumoral, pois age, estimulada principalmente pelo p53, na parada do ciclo celular, através de sua ligação com as proteínas quinases dependentes de ciclina (Cdks) e com o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Assim, alterações na molécula do p21 podem levar a uma perda da sua função anti-proliferativa, criando uma predisposição ao desenvolvimento de neoplasias malignas. Assim, o objetivo desse estudo foi analisar, através da técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase), do SSCP (polimorfismo de conformação de fita única) e seqüenciamento de algumas amostras, a presença de alterações nos exons 2 e 3 do gene WAF1 e comparar tais alterações com a expressão imunohistoquímica da proteína p21 nos carcinomas epidermóides orais. Para isso, foram utilizados 31 casos de carcinomas epidermóides orais e seus respectivos tecidos normais adjacentes e 50 salivas de indivíduos normais. Não foi identificado nenhum tipo de mutação nos exons 2 e 3 do gene WAF1. Entretanto, foram identificados através da técnica do PCR-SSCP dois polimorfismos genéticos no exon 2 e um polimorfismo no exon 3 do gene WAF1. Um dos polimorfismos descritos no exon 2 confirmou ser, através do seqüenciamento das amostras, a troca AGC (Ser)?AGA (Arg) no códon 31. Esse polimorfismo foi mais freqüente nos carcinomas (32,3 por cento) do que na população normal (12 por cento), diferença considerada estatisticamente significante (P?0,05). O outro polimorfismo identificado no exon 2 do gene WAF1 também foi mais freqüente nos tumores (41,9 por cento) do que na população normal (4 por cento) (P?0,05). O polimorfismo identificado no exon 3 do gene WAF1 também foi mais freqüente nos tumores (32,3 por cento) do que na população normal (14 por cento) (P?0,05). Não houve diferença na expressão imunoistoquímica da proteína p21 entre os tumores que exibiam e não exibiam os polimorfismos para os exons 2 e 3 do gene WAF1 . Assim, foi concluído que possivelmente os polimorfismos genéticos presentes no gene WAF1 estão envolvidos no desenvolvimento e/ou progressão dos carcinomas epidermóides orais

Comparison between immunohistochemical expression of cyclin D1 and p21 and histological malignancy graduation of oral squamous cell carcinomas

A proposição desse trabalho foi correlacionar a expressão das proteínas ciclina D1 e p21 em 28 casos de carcinomas epidermóides de boca, e comparar a expressão das mesmas com os escores histológicos de malignidade atribuídos para essa neoplasia. A expressão das proteínas foi obtida através da utilização da técnica imuno-histoquímica da Streptoavidina-Biotina. A análise estatística revelou não haver correlação entre a expressão da ciclina D1 e do p21 nos carcinomas epidermóides estudados. Não houve correlação entre os números médios de núcleos ciclina D1 e p21 positivos e os escores histológicos de malignidade atribuídos para os carcinomas estudados. Entretanto, houve uma ligeira tendência de maior expressão da ciclina D1 nos tumores de alto grau de malignidade, isso provavelmente ocorreu devido a maior atividade proliferativa desses tumores. Já a alta expressão encontrada para o p21 nos tumores estudados sugere que ele sozinho parece ser um ineficiente supressor tumoral.