Validación técnica de una PCR: Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Chlamydia trachomatis / Technical validation of a polymerase chain reaction for Chlamydia trachomatis detection

Resumen Objetivo: Estandarizar una técnica de PCR para la detección de Chlamydia trachomatis. Materiales y método: Estudio experimental en el que se optimizaron las condiciones de PCR para la detección in vitro de C. trachomatis. Se utilizó ADN de C. trachomatis VR885D y los cebadores CtP15'-TAGTAACTGCCACTTCATCA-3'y CtP2 5'- TTCCCCTTGTAATTCGTTGC-3, que amplificaron un segmento de 201 pb del plásmido clamidial. Se realizaron diluciones logarítmicas de ADN clamidial y fueron empleados para determinar la sensibilidad analítica expresada como copias de plásmidos y/o de cuerpos elementales. La especificidad analítica de la prueba se evaluó usando los cebadores CtP1 y CtP2 y ADN de microorganismos colonizadores y/o patógenos urogenitales. La variabilidad intraensayo fue evaluada sobre muestras por triplicado, mientras que la variabilidad interensayo se determinó mediante comparación de los resultados obtenidos por tres técnicos en diferentes días. Resultados: Las condiciones de PCR para la amplificación del gen de interés fueron establecidas (94°C/4 min; 40 ciclos de 94°C/1 min, 56°C/1 min. y 72°C/1.5 min; 72°C/4 min); 1.5 mM MgCl2 y 1 U/pL Taq polimerasa. La sensibilidad analítica de la PCR fue de 10-17 g de ADN, equivalentes a una copia del plásmido o menos de un cuerpo elemental de C. trachomatis. Los cebadores CtP1 y CtP2 amplificaron específicamente el ADN de C. trachomatis bajo las condiciones experimentales evaluadas. La repetitibilidad y reproducibilidad de la PCR se determinó con experimentos de variabilidad intra e interensayo respectivamente. Conclusiones: La estandarización de esta PCR es el primer paso para su utilización en el diagnóstico de infecciones por C. trachomatis. Se requieren estudios adicionales de validación clínica de ésta prueba.

Abstract Objective: To standardize a PCR for Chlamydia trachomatis detection. Materials and methods: An experimental study was designed to standardize a C. trachomatis PCR test. Genomic DNA from C. trachomatis serovar D ATCC VR885D was used for the PCR standardization. An amplicon of 201 bp from clamidial plasmid was obtained using primers CtP15'-TAGTAACTGCCACTTCATCA-3' and CtP2 5'- TTCCCCTTGTAATTCGTT-GC-3'. Serial dilutions of clamidial DNA were used to determine the analytical sensitivity. Analytical specificity was tested using DNA from several urogenital microorganisms. Intra assay variability was assessed on triplicate DNA samples, while inter assay variability was assessed comparing the results by three technicians on different days. Results: Established (94°C/4 min; 40 cycles at 94 °C/1 min, 56°C/1 min and 72°C/1.5 min; 72°C/4 min; 1.5 mM of MgCl2 and 1U/pL of Taq polymerase. The analytical sensitivity was 10-17 g of DNA equivalent to one plasmid or less than one elementary body from C. trachomatis. Primers CtP1 and CtP2 amplified specifically C. trachomatis in the experimental conditions evaluated. Intra and inter assay variability demonstrated the repeatability and reproducibility of the PCR respectively. Conclusions: We standardized the experimental conditions for a C. trachomatis PCR that can be used for diagnostic purposes. Other studies are required for further clinical evaluation of this test.