Evaluation of the “shelf life” of nitrocellulose membranes immobilized with Paracoccidioides brasiliensis antigen for performing the immunodiagnosis of paracoccidioidomycosis / Avaliação do “tempo de prateleira” de membranas de nitrocelulose imobilizadas com antígeno de Paracoccidioides brasiliensis para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose

Considerando-se que o immunoblotting para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose (PCM) é uma metodologia in house e laboriosa envolvendo duas etapas iniciais, SDS-PAGE e Western blot, neste estudo foi avaliado o tempo de prateleira das membranas de nitrocelulose sensibilizadas com antígeno de P. brasiliensis, armazenadas a -20 oC durante 7, 15, 30, 45, 60 e 90 dias. Vinte e oito amostras de soro foram analisadas em dois grupos de membranas de nitrocelulose (membranas previamente bloqueadas com PBS-leite 5 % e as não-bloqueadas). Não houve diferença no padrão de reatividade quando os soros foram avaliados frente a ambos os grupos, especialmente para membranas armazenadas por 7, 15, 30, 45 e 60 dias. A boa estabilidade do antígeno utilizado para sensibilizar as membranas fez com que estas pudessem ser armazenadas a -20 °C até 60 dias. Estas características contribuem para efetuar o diagnóstico rápido da PCM, bem como as perspectivas dessas membranas sensibilizadas serem encaminhadas para os laboratórios, que não possuam infraestrutura necessária para executar as etapas que antecedem a realização de immunoblotting, como a produção de antígeno, as técnicas de SDS PAGE e Western blot. Este procedimento contribui substancialmente para melhorar o diagnóstico sorológico da PCM, pois poderá fornecer resultados reprodutíveis nas unidades componentes da Rede de Laboratórios.

The immunoblotting reaction for performing the paracoccidioidomycosis (PCM) immunodiagnosis is an in-house methodology; and being a laborious task involving two previous steps, SDS-PAGE and Western blot, we evaluated the shelf life of nitrocellulose membranes containing the immobilized P. brasiliensis antigens, stored at -20 oC for 7, 15, 30, 45, 60 and 90 days. Twenty-eight serum samples were analyzed on two nitrocellulose membranes groups: (a) membranes previously blocked with PBS-5 % non-fat dry milk and (b) the priory non-blocked membranes. No difference was detected in the reactivity pattern in serum samples evaluated in the both membrane groups, especially for those stored for 7, 15, 30, 45 and 60 days. It might be emphasized that a good stability of P. brasiliensis antigens, immobilized on the nitrocellulose membranes, enable them to be stored up to 60 daysat -20 oC. This finding contributes to the rapid diagnosis of PCM, and for sending them to other laboratories without adequate infrastructure for carrying out the steps that precede the immunodetection as the antigen production, SDS-PAGE and Western blot techniques. This scheme contributes substantially to improve the quality of PCM serodiagnosis, as it provides reproducible results in the units of the Laboratory Network.

Immunological assays employed for the elucidation of an histoplasmosis outbreak in São Paulo, SP

Several reports showed outbreaks of histoplasmosis acquired while bat-inhabited caves were visited by tourists, miners or researchers. We evaluated the performance of double immunodifusion (DI) and immunoblotting (IB) assays, employed for the histoplasmosis outbreak elucidation occurred in Vale do Paraíba, São Paulo. The existence of epidemiologic link, four patients with clinical signs suggestive of histoplasmosis and mycological confirmation has made that all 35 individuals involved to the cave visit were subjected to serological evaluation. By DI, we observed reactivity against H. capsulatum antigen in a single serum examined nearly 20 days after exposure to fungal propagules. On the other hand, IB showed reactivity against H and M fractions in 50% of samples evaluated. The analysis of the second sample batch, collected two months after the exposure showed that 96.7% were reactive by DI with antibodies titers ranging from 1 to 16 and 100% of reactivity against H and M fractions, by IB, suggesting an acute infection. The analysis of the overall agreement between the methods showed to be reasonable (κ = 0.37). This study confirms the importance and efficacy of more sensitive methodologies, such as IB assay, to early elucidation of disease, especially in cases of patients without mycological information.

Histoplasmose: um risco ocupacional entre pesquisadores que realizam trabalho de campo? / Is the histoplasmosis an occupational hazard between the investigators who perform field work?

A histoplasmose é micose sistêmica causada por Histoplasma capsulatum. A infecção humana ocorre pela inalação de microconídios encontrados em solo contendo excretas de aves e/ou morcegos. Neste estudo foi enfatizado o potencial das atividades profissionais praticadas em cavernas em possibilitar risco de infecção por Histoplasma. Utilizando-se questionário semi estruturado, foram obtidas informações sobre o trabalho de campo executado por um grupo de 15 biólogos. A presença de anticorpos séricos anti-H.capsulatum foi avaliada em amostras de sangue coletadas desses profissionais. Na entrevista, 87 por cento dos indivíduos relataram frequentes visitas a cavernas, 53 acampamento no interior das grutas; 33 por cento captura de morcegos e 53 por cento de coleta de amostras de solo. A maioria das cavernas situa-se nas regiões sudeste e centro-oeste do Brasil. A detecção de anticorpos por imunodifusão dupla demonstrou que 20 por cento dos soros reagiram com o antígeno de H. capsulatum. Por immunoblotting, houve 94,1 por cento de reconhecimento específico da fração de 94 kDa, sugerindo-se que os indivíduos entraram em contato com H. capsulatum. Este estudo sugere fortemente que a prática da espeleologia propicia a exposição dos indivíduos a espécies fúngicas que habitam saprofiticamente o meio ambiente, especialmente H. capsulatum, configurando-se como potencial fator de risco para infecções.

Avaliação da aplicabilidade da técnica de immunoblotting para a pesquisa de anticorpos circulantes anti-Paracoccidioides brasiliensis e anti-Histoplasma capsulatum em laboratório de saúde pública / Evaluation of the immunoblotting assay applicability for the antibodies detection anti-Paracoccidiides brasiliensis and anti-Histoplasma capsulatum on public health laboratory

Nos últimos anos, a frequência das infecções fúngicas invasivas tem aumentado substancialmente, tornando-se um problema emergente em Saúde Pública. O emprego de imunoensaios é de vital importância no diagnóstico dos processos infecciosos por Paracoccidioides sp e Histoplasma capsulatum, visto que o isolamento e identificação bem como a visualização, por exame direto, destes patógenos apresentam limitações metodológicas. O uso simultâneo de mais de uma metodologia é imprescindível para rápida e eficiente elucidação da etiologia da doença, proporcionando um tratamento específico e adequado. Neste estudo padronizou-se o ensaio de immunoblotting (IB), visando à pesquisa de anticorpos espécie-específicos, avaliando seu desempenho e aplicabilidade na rotina de Laboratório de Saúde Pública. Desta forma, realizou-se alterações no protocolo de referência, priorizando a otimização da metodologia. Foram analisadas, por imunodifusão dupla (ID) e IB, amostras de soro de pacientes classifica no critério de casos confirmados, prováveis, suspeitos e descartados de paracoccidioidomicose (PCM) e histoplasmose (HP); soros de indivíduos hígidos e de pacientes com aspergilose. Nas diversas avaliações, a sensibilidade do teste de ID paraPCM, variou de 69 a 91%; com especificidade de 100% e eficiência entre 90 e 99%. No método de IB a sensibilidade calculada ficou entre 75 e 96%; com especificidade entre 93 e 100% e eficiência de 90 a 99%. Na pesquisa de anticorpos anti-H. capsulatum, a ID apresentou sensibilidade entre 56 a 96%, especificidade de 100% e eficiência variando de 92 a 99%. Por sua vez, a sensibilidade do IB foi de 100% em pacientes com HP pulmonar aguda e de 36% naqueles com forma disseminada; a especificidade variou de 79 a 87% e a eficiência entre 79 a 83%. Apesar das limitações, os imunoensaios são ferramentas fundamentais para o diagnóstico e monitoramento das micoses sistêmicas, principalmente...