Morpho-anatomy of in vitro germination and cryopreservation of the orchid Cattleya crispa (Orchidaceae Morfoanatomía de la germinación in vitro y criopreservación de la orquídea Cattleya crispa (Orchidaceae) / Morfoanatomía de la germinación in vitro y criopreservación de la orquídea Cattleya crispa (Orchidaceae)

Introduction: Cattleya crispa is an ornamental epiphytic orchid with geographic distribution restricted to the Brazilian Atlantic Forest. Due to predatory extractivism and human-induced habitat loss, this species appears on the Red List of Brazilian Flora. Objective: To characterize morpho-anatomical aspects regarding germination and post-seminal development from C. crispa seeds; as well as studying the effect of cryopreservation on these seeds. Methods: We used light microscopy and electron microscopy to describe the microstructure of a 100 ripe seeds. We evaluated seed viability, seed germination, survival rate and protocorm weight in cryopreserved and non-cryopreserved material, with four replicas per treatment using 20 mg of plant material. Results: The seeds are fusiform, whitish yellow with a length from 700 to 900 µm and a water content of 5 %. Germination began seven days after sowing, the formation of the globular protocorm at 30 days and the formation of the seedling occurred 150 days. The persistent seed coat can compress the protocorm and cause it to collapse. The cryopreserved seeds presented 87.15 % viability, 78.32 % germination, 8.48 % survival and protocorms with 104.27 mg five months after sowing. Data wasn't different to non-cryopreserved seeds. Conclusions: The cryocapability of the seeds shows that cryopreservation can be used for long-term conservation. The results of this work contribute to the overall biology of C. crispa and to the propagation and storage of genetic material for conservation purposes.

Introducción: Cattleya crispa es una orquídea epífita ornamental con distribución geográfica restringida a la Mata Atlántica brasileña. Debido al extractivismo depredador y a la pérdida de hábitat inducida por el hombre, esta especie aparece en la Lista Roja de la Flora Brasileña. Objetivo: Caracterizar aspectos morfoanatómicos de la germinación y desarrollo inicial de semillas de C. crispa; así como estudiar el efecto de la criopreservación de estas semillas. Métodos: Utilizamos microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión para describir la microestructura en 100 semillas maduras. Evaluamos la viabilidad de la semilla, la germinación de la semilla, la tasa de supervivencia y el peso de los protocormos en el material criopreservado y no criopreservado, con cuatro réplicas por tratamiento de 20 mg de material vegetal. Resultados: Las semillas son fusiformes, amarillo blanquecinas, con una longitud de 700 a 900 µm y un contenido de agua del 5 %. La germinación comenzó siete días después de la siembra, la formación del protocormo globular a los 30 días y la formación de la plántula a los 150 días. La cubierta de semilla persistente puede comprimir el protocormo y provocar su colapso. Las semillas criopreservadas presentaron 87.15 % de viabilidad, 78.32 % de germinación, 8.48 % de supervivencia y protocormos con 104.27 mg a los cinco meses de la siembra. Los datos no fueron diferentes a las semillas no criopreservadas. Conclusiones: La capacidad criogénica de las semillas muestra que la crioconservación puede utilizarse para la conservación a largo plazo. Los resultados de este trabajo contribuyen a la biología general de C. crispa y a la propagación y almacenamiento de material genético con fines de conservación.

Determination of endogenous IAA and carbohydrates during the induction and development of protocorm-like bodies of Cattleya tigrina A. Richard / Determinação de AIA e carboidratos endógenos durante a indução e desenvolvimento deestruturas semelhantes a protocormos de Cattleya tigrina A. Richard

Tissue culture techniques have been employed for orchid mass propagation by means of themorphogenetic route of protocorm like-bodies (PLBs). This study aimed to analyze and compare Indoleaceticacid (IAA) and sugar endogenous levels in protocorm-like bodies (PLBs) induction and developmentin Cattleya tigrina, in order to better understand this process and to optimize micropropagation procedureprotocols. Leaves grown on MS (Murashige and Skoog) culture medium, suplemented with 9 μM TDZfor PLBs induction and development were collected after 0, 2, 7, 14, 30, 60 and 100 days of cultivation, forfurther analysis. Increase of IAA and reduction of sugar levels are strongly related to morphogeneticresponse, that is, PLBs formation over the preexisting ones and leaf primordia formation. Sucrose, fructoseand glucose presence in this study is related to cell signaling. Thus, hormonal signals and carbohydratesalter metabolism, triggering PLBs initiation and development in C. tigrina.

Técnicas de cultura de tecidos têm sido empregadas para a propagação em massa de orquídeaspor meio da via morfogenética de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs). O estudo teve comoobjetivo analisar e comparar os níveis endógenos de ácido indol-3-acético (AIA) e de açúcares na indução eno desenvolvimento de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) em Cattleya tigrina, visando à melhorcompreensão deste processo e à otimização de protocolos de micropropagação. Folhas cultivadas em meiode cultura MS (Murashige & Skoog), suplementadas com 9 μM de TDZ para indução e desenvolvimentode ESPs foram coletadas após 0, 2, 7, 14, 30, 60 e 100 dias de cultivo, para posterior análise. O aumento dosníveis de AIA e a redução dos níveis de açúcar estão fortemente relacionados à resposta morfogenética, ouseja, à formação de ESPs sobre os pré-existentes e à formação de primórdios foliares. A presença desacarose, frutose e glicose neste estudo está relacionada à sinalização celular. Assim, sinais hormonais ecarboidratos alteram o metabolismo, desencadeando a iniciação e o desenvolvimento de ESPs em C. tigrina.

Dynamics in global DNA methylation and endogenous polyamine levels during protocorm-like bodies induction of Cattleya tigrina A. Richard / Dinâmica da metilação do DNA global e níveis endógenos de poliaminas durante a indução de estruturas semelhantes a protocormos de Cattleya tigrina A. Richard

Cattleya tigrina is endemic to the Atlantic forest biome and classified as vulnerable in the Red Book of Brazilian Flora. In vitro techniques comprise valuable tools for the conservation of endangered plant species. The aim of the present study was to evaluate the morphological features, global DNA methylation levels and free polyamines during protocorm- like bodies (PLBs) induction of C. tigrina. Along with that, an efficient protocol for in vitro propagation of this species is proposed. The first evidences of PLBs induction in C. tigrina occurred at seven days in culture, starting from the basal portion of the leaf abaxial surface. A hypomethylation marked the beginning of cell differentiation, followed by an increased global DNA methylation at 35 days in culture, coinciding with a subtle change in the structures morphogenetic development. During PLBs induction, putrescine exhibited higher levels as compared to spermidine and spermine, and apparently presents a major role during the PLBs induction in C. tigrina. Due to the apparent secondary PLBs formation, this protocol can represent a highly efficient method for in vitro propagation of this species.

Cattleya tigrina é uma espécie endêmica do bioma Mata Atlântica e classificada como vulnerável no Livro Vermelho da Flora Brasileira. As técnicas in vitro compreendem ferramentas valiosas a serem empregadas na conservação de espécies de plantas ameaçadas. O objetivo do presente estudo foi avaliar as características morfológicas, os níveis globais de metilação do DNA e as poliaminas livres durante a indução de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs). Paralelamente, um protocolo eficiente para a propagação in vitro desta espécie é apresentado. As primeiras evidências de indução de ESPs em C. tigrina foram observadas aos sete dias de cultivo, a partir da porção basal da superfície abaxial da folha. Uma hipometilação foi observada concomitante ao início da diferenciação celular, e um aumento da metilação global do DNA foi encontrada aos 35 dias de cultivo, coincidindo com uma sutil mudança no desenvolvimento morfogenético das estruturas. Durante a indução de ESPs, a putrescina exibiu níveis aumentados em comparação a espermidina e espermina e, aparentemente, apresenta um papel importante durante a indução dessas estruturas em C. tigrina. Devido à aparente formação secundária de ESPs, este protocolo pode representar um método altamente eficiente para a propagação in vitro desta espécie.

In vitro propagation of Vriesea reitzii, a native epiphyte bromeliad from the Atlantic rainforest / Propagação in vitro de Vriesea reitzii, uma bromélia epífita nativa da Mata Atlântica

The induction of nodular culture (NC) and the subsequent development of microshoots of V. reitzii are considered an in vitro propagation model-system with high regenerative performance. Current research analyzed the determinant factors of the in vitro morphogenesis control of bromeliads. Seeds excised from mature capsules were grown on medium MS basic (MSB), liquid or gelled, supplemented or not with α- naphthaleneacetic acid (NAA), 6-benzilaminopurine (BAP) or thidiazuron (TDZ). The regeneration and elongation of microshoots were evaluated from NC sub-cultivated on MSB medium on liquid culture medium supplemented with different concentrations of indolyl-3-acetic acid (IAA) and gibberellic acid (GA3). Plant growth regulators (PGR) supplemented into the medium MSB inhibited the germination of the seeds and induced NC in the second week of growth. The induced NC on MSB medium with NAA (4 µM) and sub-cultivated on MSB medium with NAA (2 µM) plus N6(2-isopentenyl) adenine (2-iP) (2 µM) showed granular texture and high rate of proliferation. NC sub-culture in MSB medium with IAA (4 µM) provided a higher average number of microshoots (1,478 shoots g-1 of NC). Shoots over 3.0 cm resulted in more than 95% ex vitro survival.

A indução de culturas nodulares (CNs) e subsequente desenvolvimento de microbrotos de V. reitzii configuraram-se em um sistema de alta performance regenerativa in vitro. No presente trabalho foram estudados os fatores determinantes do controle da morfogênese in vitro das CNs. Sementes excisadas de cápsulas maduras foram cultivadas em meio básico MS (MSB) líquido ou geleificado e suplementado ou não com ácido naftalenoacético (ANA), 6-benzilaminopurina (BAP) ou thidiazuron (TDZ). A partir das CNs subcultivadas em meio MSB, foi avaliada a regeneração e o alongamento de microbrotos em meio de cultura líquido suplementado com diferentes concentrações de ácido indolil-3-acético (AIA) combinados com ácido giberélico (AG3). A suplementação de fitorreguladores ao meio MSB inibiram a germinação das sementes e promoveram a indução de CNs na segunda semana de cultivo. As CNs induzidas em meio MSB suplementado com ANA (4 µM) e subcultivadas em meio MSB suplementado com ANA (2 µM) mais N6(2-isopentenil) adenina (2-iP) (2 µM) apresentaram textura granular e alta taxa de proliferação. O cultivo destas CNs em meio MSB suplementado com AIA (4 µM) resultou no maior número médio de microbrotos (1.478 brotos g -1 de CN). Brotos maiores de 3,0 cm resultaram em mais de 95% de sobrevivência em ambiente ex vitro.

Physiological characteristics of the Atlantic Forest native bromeliads: Nidularium campo-alegrense Leme and Aechmea ornata Baker / Características fisiológicas de bromélias nativas da Mata Atlântica: Nidularium campo-alegrense Leme e Aechmea ornata Baker

Despite the ecological importance of bromeliads, the basic knowledge about the physiological aspects in some species is poorly understood. The aim of this study was to physiologically characterize the species Nidularium campo-alegrense Leme and Aechmea ornata Baker to contribute to a better understanding of their metabolic processes. From mature leaves of bromeliads N. campo-alegrense and A. ornata held at the Agricultural Sciences Center of the Federal University of Santa Catarina, it was quantified photosynthetic pigments, carbohydrates and starch, and determined stomata and trichome density. The chlorophyll and carotenoids content did not differ significantly between species. However, the total carbohydrates content of A. ornata (3.2 mg g- 1 FM) was significantly higher than N. campo-alegrense, but with similar starch content (1.7 mg g -1 FM). Both species present hypostomatic leaves, with more trichomes in the species A. ornata. This information provides the groundwork for future studies on the biochemical mechanisms related to their photosynthetic process, contributing in establishing strategies for the conservation and propagation of these species.

Apesar da importância ecológica das bromélias, o conhecimento básico sobre os aspectos fisiológicos em algumas espécies é pouco compreendido. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar fisiologicamente as espécies Nidularium campo-alegrense Leme e Aechmea ornata Baker, para contribuir ao melhor entendimento dos seus processos metabólicos. Pelas folhas maduras, das bromélias N. campo-alegrense e A. ornata mantidas no Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), foram quantificados os pigmentos fotossintéticos, carboidratos e amido e foi determinada a densidade estomática e tricomática. Os teores de clorofila e carotenoides não apresentaram diferença significativa entre as espécies. No entanto, na espécie A. ornata, o teor de carboidratos totais (3,2 mg g-1 MF) foi significativamente maior e o teor de amido (1,7 mg g-1 MF) semelhante quando comparado com N. campo-alegrense. As duas espécies apresentam folhas hipoestomáticas e o número de tricomas foi maior na espécie A. ornata . Estas informações fornecem as bases para futuros estudos sobre os mecanismos bioquímicos relacionados com seu processo fotossintético para contribuir no estabelecimento de estratégias de conservação ou propagação destas espécies.