ABSTRACT
Se ha reportado cultivo axénico de amastigotas de Trypanosoma cruzi derivados de epimastigotas. Se cuestiona si formas redondas en cultivos axénicos son verdaderos amastigotas. Aquí se compararon los cambios biológicos y moleculares de epimastigotas creciendo en alta y baja tensión de oxígeno. T. cruzi (EPm6) se creció en frascos con diferentes alturas de medio LITB (condición horizontal 3 mm y vertical 83 mm). Se colectaron masas de parásitos de diferentes tiempos de crecimiento para análisis proteico, glicoproteico y antigénico. Se estudiaron los cambios morfológicos, incremento de inóculo y resistencia al complemento por microscopia de fases y tinción con Giemsa. Los cambios proteicos y glicoproteicos se compararon por SDS-PAGE. Los cambios antigénicos se analizaron por Western blot con suero de conejo y anticuerpos IgY contra formas amastigotas. En condición vertical, los epimastigotas mantuvieron su morfología típica a lo largo de la curva de crecimiento y no mostraron cambios moleculares significativos. En condición horizontal al 4to y 6to día predominaron formas redondas con capacidad de resistir la lisis por complemento. A partir del 4to día se observaron cambios en los perfiles proteicos y glicoproteicos, concomitantemente con los cambios morfológicos. El suero anti-amastigotas reveló un antígeno amastigota-específico transitorio de 55 kDa en parásitos de 4 días en la condición horizontal, mientras el anticuerpo IgY anti-amastigotas no reveló diferencias entre parásitos creciendo en ambas condiciones. Estas evidencias sugieren que epimastigotas de T. cruzi condicionados a sobrevivir en alta tensión de oxígeno puede mimetizar propiedades biológicas y antigénicas propias del estadio amastigota.
Axenic culture of epimastigote-derived amastigotes of Trypanosoma cruzi has been reported. Have been inquired why round forms appear in culture media and if are true amastigotes. Our proposal was study molecular and biological changes in epimastigotes growing in high and low oxygen tension. T. cruzi (EPm6) were grown in flasks with different height of LITB medium (horizontal condition 3 mm and vertical 83 mm). Parasites were collected masses of different times of growth for proteins, glycoproteins and antigenic analysis. Morphological changes, increase of inoculum and resistance to complement lyses were studied in phases microscopy and Giemsa-stained smears. Protein and glycoprotein changes were compared by SDS-PAGE. Antigenic changes were analyzed by Western blot with rabbit serum and IgY antibody against amastigote forms. In vertical condition, the epimastigote maintained its typical morphology along the growth curve and not showed significant molecular changes. In horizontal condition round forms prevailed at 4 and 6 days with capacity to resist lyses by complement. From the 4th day changes in proteins and glycoproteins profiles were observed, concomitantly with the morphological changes. Anti-amastigotes serum revealed a 55 kDa transitory amastigote-specific antigen in four day parasites from horizontal condition, while IgY antibody anti-amastigotes dont revealed differences between parasites grown in both conditions. These evidences suggest that epimastigotes of T. cruzi conditioned to survive in high oxygen tension can mimic biological and antigenic properties own the amastigote-stage.
ABSTRACT
El medio ML15-HA permite simular in vitro los eventos morfogenéticos del ciclo vital de T. cruzi. Se ha evidenciado que los cambios morfológicos de la epimastigogénesis del clon Dm28c de T. cruzi en ML15-HA, ocurren más rápidamente que para otros aislados. Nuestro propósito fue investigar si los cambios macromoleculares ocurren concomitantemente con la rápida transformación morfológica. Tripomastigotas derivados de células infectadas se incubaron por diferentes tiempos en medio ML15-HA a 27ºC. Los cambios morfológicos se determinaron por microscopía de contraste de fases y coloración con Giemsa. Los perfiles peptídico y glicopeptídico se analizaron mediante SDS-PAGE y coloraciones específicas. Los cambios antigénicos se estudiaron mediante Western blot usando sueros anti-Tripomastigotas y anti-Epimastigotas. Los resultados muestran: (1) caída del porcentaje de tripomastigotas e incremento de amastigotas en las primeras 24 horas, con incremento gradual de epimastigotas a partir de 48 horas; (2) tres perfiles peptídicos y glicopeptídicos diferentes: tripomastigotas, epimastigotas a partir del día 4, y un perfil intermedio los días 2 y 3, demostrando la estrecha correlación entre los eventos morfológicos y los cambios proteicos y glicoproteicos; (3) los perfiles antigénicos revelaron estrecha relación entre los cambios morfológicos y la expresión de antígenos estadio-específicos. Los resultados obtenidos evidencian de manera concluyente que los cambios moleculares son más acelerados para el clon Dm28c en medio ML15-HA que en otros medios. Estos hallazgos abren la interrogante, sí la velocidad de la epimastigogénesis está determinada por la constitución genética del aislado o por la riqueza nutricional del medio de diferenciación.
The ML15-HA medium allows simulate in vitro morphogenetic events in the life cycle of T. cruzi. It has been demonstrated that the morphological changes of epimastigogenesis in ML15-HA of the T. cruzi clone Dm28c, occur faster than for other isolates. Our purpose was to investigate whether macromolecular changes occur concomitantly with rapid morphological transformation. Trypomastigotes derived from infected cells were incubated for different times in ML15-HA medium at 27°C. Morphological changes were determined by phase contrast microscopy and staining with Giemsa. Peptide and glycopeptide profiles were analyzed by SDS-PAGE and specific staining. Antigenic changes were studied by Western blot using serum anti-trypomastigotes and anti-epimastigotes. The results show: (1) decline in the percentage of trypomastigotes and amastigotes increased in the first 24 hours, epimastigotes gradually increases from 48 hours, (2) three peptide and glycopeptide profiles different: trypomastigotes, epimastigotes from the day 4 and an intermediate profile on days 2 and 3, showing the close correlation between morphological events and protein and glycoprotein changes, (3) antigenic profiles showed close relationship between the morphological changes and the expression of stage-specific antigens. The results show conclusively that the molecular changes are more rapid for clone Dm28c in ML15-HA medium than in other media. These findings open the question, if the epimastigogenesis speed is determined by the genetic constitution of isolated or nutritional wealth differentiation medium.
ABSTRACT
La metaciclogénesis de Trypanosoma cruzi es la transformación del estadio epimastigota en tripomastigota metacíciclico que ocurre en la ampolla rectal del insecto vector. Durante este proceso se ha implicado una activación del metabolismo proteico, con probable participación de proteasas en la degradación de proteínas del parásito. En el presente trabajo se determinó el efecto de las condiciones de mantenimiento de T. cruzi en el laboratorio sobre la actividad de proteasas y su relación sobre la metaciclogénesis espontánea en cultivos axénicos. Se trabajó con el clon Dm30L de Trypanosoma cruzi mantenido en el laboratorio mediante pases trimestrales chipo-ratón (condición triatomino: CT) o repiques semanales durante 15 años en medio LITB (condición cultivo: CC). En ambas condiciones, se hizo curva de crecimiento durante 30 días en medio LITB suplementado con 10, 24 y 48 mM glucosa, calculándose el porcentaje de metacíclicos espontáneos y determinación de la actividad de proteasas. En 10 mM glucosa, parásitos de la CT presentaron mayor expresión de proteasas y porcentaje de metacíclicos respecto a la CC. En la CT, el crecimiento en 48 mM glucosa redujo las variables antes mencionadas, mientras que no se evidenció actividad proteolítica ni metaciclogénesis espontánea en parásitos de la CC en altas concentraciones de glucosa. En todos los casos se evidenció mayor actividad de cisteín proteasas durante la fase estacionaria del cultivo. No se reportó actividades metaloproteasas en ninguna de las condiciones estudiadas, pero sí en el clon Dm28c utilizado como control de la expresión de este tipo de enzima. Estos resultados sugieren que la expresión de proteasas está influenciada por la constitución genética del parásito y que la CC provoca disminución de la actividad proteolítica que persisten aún en condiciones de agotamiento de carbohidratos del medio, con una concomitante reducción significativa en el porcentaje de metacíclicos espontáneos.
Trypanosoma cruzi metacyclogenesis is the transformation of epimastigote stage to trypomastigote metacyclic that happens in the rectal ampulla of the insect vector. During this process it has been implicated protein metabolism activation, with proteases likely involvement in parasite protein degradation. In this study we determined the effect of T. cruzi keeping conditions in the laboratory on the activity of proteases and their relationship on spontaneous metacyclogenesis in axenic culture. We worked with Trypanosoma cruzi Dm30L clone maintained in the laboratory by quarterly passes triatomine-mouse (triatomine condition: TC) or serial culture media during 15 years in LITB medium (culture condition: CC). In both conditions, growth curve was made for 30 days in LITB medium supplemented with 10, 24 and 48 mM glucose, calculating the percentage of spontaneous metacyclics and determining proteases activity. In 10 mM glucose, TC parasites showed higher expression of proteases and metacyclic percentage relative to the CC. In TC, the growth in 48 mM glucose reduced the above variables, while no evidenced proteolytic activity nor spontaneous metacyclogenesis on CC parasites in high glucose concentrations. In all cases there was greater cysteine proteases activity during the stationary phase of the culture. Metalloprotease activity was not reported in any of the conditions studied, but it was detected in clone Dm28c used as control of expression of this type of enzyme. These results suggest that the expression of proteases is influenced by the genetic makeup of the parasite and the CC causes decrease of proteolytic activity which persists even in carbohydrate depleted conditions of the medium, with a concomitant significant reduction in the percentage of spontaneous metacyclics.
ABSTRACT
La epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi ocurre naturalmente en el intestino del hospedador invertebrado. Se desconoce si los cambios morfológicos que ocurren durante la transformación de los tripomastigotas sanguíneos en epimastigotas son idénticos para diferentes aislados de T. cruzi. Aquí mostramos un método útil para estudiar los eventos que ocurren durante la epimastigogénesis, comparando parásitos de diferentes procedencias epidemiológicas. Se alimentaron artificialmente ninfas de V estadio de Rhodnius prolixus con una solución ad hoc conteniendo tripomastigotas tipo-sanguíneo y siguiendo los cambios morfológicos por 8 días. Los contenidos del intestino anterior de las ninfas se obtuvieron decapitando y comprimiendo el abdomen lo que permitió obtener rápidamente casi 100% del inóculo con cargas entre 1,9 y 8,9 × 106 tripomastigotas/ninfa. El número de parásitos por ninfa y los cambios morfológicos se determinaron por Microscopia de Contraste de Fases y coloración con Giemsa. Las ninfas ingirieron 7,4 veces su peso de solución infectante, con volúmenes entre 101 y 357 µL (229 ± 66 mg), 50% de esa ingesta se eliminó como orina durante las primeras 24 h. Los tripomastigotas se transformaron en formas redondeadas antes de evolucionar a epimastigotas, siguiendo cinéticas diferentes según el aislado. Proponemos esta metodología para estudiar rápida y cuantitativamente los eventos tempranos de la epimastigogénesis de T. cruzi in vivo.
Trypanosoma cruzi epimastigogenesis naturally occurs in the intestine of the invertebrate host. It is not known whether the morphological changes that occur during transformation of bloodstream trypomastigotes to epimastigotes are identical for different T. cruzi isolates. This research shows a useful method for studying the events that occur during epimastigogenesis, comparing parasites from epidemiological sources. Rhodnius prolixus V stage nymphs were fed artificially with an ad hoc solution containing blood-like trypomastigotes and the morphological changes were examined during eight days. Anterior intestinal contents were removed by decapitation and squeezing the abdomen of the nymphs, which permitted obtaining quickly almost 100% of the inoculate with loads between 1.9 and 8.9 × 106 trypomastigotes/nymph. The number of parasites per nymph and morphological changes were determined using phase microscopy with Giemsa staining. The nymphs ingested 7.4 times their weight of the infecting solution with volumes between 101 e 357 µL (229 ± 66 mg); 50% of the ingest was eliminated as urine during the first 24 hours. The trypomastigotes transformed to rounded forms before evolving into epimastigotes following different kinetics according to the isolate. This method is proposed for rapid, quantitative study of the early events of epimastigogenesis for T. cruzi in vivo.