Diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 / Molecular diagnosis of SARS-CoV-2

Resumen El diagnóstico de COVID-19 se basa tanto en aspectos clínicos como en pruebas de detección, pero los síntomas y signos clínicos de los pacientes infectados son altamente atípicos y, por lo tanto, las pruebas moleculares son indispensables para su diagnóstico. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR) se lleva a cabo en laboratorios nivel BSL II; asimismo, los principales blancos moleculares para la detección viral son el gen E (envoltura), y el gen RdRP (ARN polimerasa dependiente de ARN). Los falsos negativos en este diagnóstico se deben a la calidad y cantidad de la muestra, condiciones de transporte, almacenamiento, y manejo de estas antes y después de la extracción (el ARN es termolábil y abundantes las RNasas), fase de la infección, mutaciones del virus y presencia de inhibidores de la PCR. En estos casos, se recomienda una nueva toma de muestra, especialmente de vías respiratorias bajas, para aumentar la carga viral. Se debe tener en cuenta la sensibilidad analítica de la RT-qPCR (5,2 copias de ARN/reacción) y que, una vez el RNA se extrae, se va degradando progresivamente afectando la sensibilidad diagnóstica de la prueba. Un diagnóstico oportuno permite optimizar el manejo (aislamiento y tratamiento) y monitorización de los pacientes, así como la aplicación de medidas de prevención y control de la expansión, y la vigilancia epidemiológica de la enfermedad.

ABSTRACT COVID-19 diagnosis is based on both clinical aspects and screening tests. However, clinical symptoms and signs in infected patients are highly atypical; hence, molecular tests are essential for diagnosis. RT-qPCR is carried out at BSL II level laboratories; the main molecular targets for viral detection are E gene (envelope), and RdRP gene (RNA-dependent RNA polymerase). False negatives in this diagnosis are due to sample quality and quantity, transport conditions, storage and handling before and after extraction (RNA is heat-labile and RNases are abundant); infection phase; virus mutations and presence of CRP inhibitors. Taking into account analytical sensitivity of RT-qPCR (5.2 copies of RNA / reaction) and the fact that once RNA it is extracted, it progressively degrades and affects test diagnostic sensitivity, a new sample -specifically taken from the lower respiratory tract in order to increase viral load- is recommended in the abovementioned cases. Timely diagnosis allows optimizing management (isolation and treatment), patient monitoring, implementing prevention and control measures as well as epidemiological surveillance of the disease.

Determinación de los genes, 16S ADNr, polA, y TpN47, en la detección de Treponema pallidum subsp. pallidum para el diagnóstico de sífilis congénita / Determination of genes, 16S ADNr, polA, and TpN47, in the detection of Treponema pallidum subsp. pallidum in the diagnosis of congenital syphilis

Objetivo. Comparar el comportamiento de tres genes diana 16S ADNr, polA, y TpN47, para la detección de T. pallidum subsp. pallidum. Métodos. Se usaron técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa en muestras de cordón umbilical. Mediante PCR convencional, PCR anidada y PCR en tiempo real se amplificaron blancos moleculares del microorganismo. Resultados. Se evidenció que con los tres genes por PCR convencional se obtienen similares resultados, pero por con PCR anidada y PCR en Tiempo Real, el gen TpN47 tiene mayor sensibilidad en comparación con los genes polA y 16S ADNr. Se concluye que el gen TpN47 se puede usar como blanco molecular para el diagnóstico oportuno de sífilis congénita por medio de PCR anidada y en tiempo real, ya que alcanzó la máxima sensibilidad y especificidad en este estudio.

Objective. To compare the behavior of the three target genes (16S rDNA, polA, and TpN47) for the detection of T. pallidum subsp. Pallidum. Methods. Molecular techniques such as polymerase chain reaction were used on samples of an umbilical cord. Molecular targets of the microorganism were amplified by means of conventional PCR, nested PCR and real-time PCR. Results. Similar results for the three genes were obtained by conventional PCR; but in the case of nested PCR and real-time PCR, the gen TpN47 exhibited higher sensitivity in comparison to the genes polA and 16S rDNA. In conclusion, the gen TpN47 can be used as a molecular target for the prompt diagnosis of congenital syphilis through nested PCR and real-time PCR due to its high sensitivity and specificity shown in this study.

Determinación del gen aac(6´)-aph(2´´) asociado con resistencia a aminoglucósidos en cepas de Staphylococcus coagulasa negativa en una unidad neonatal en Bogotá / Detection of gene aac(6´)-aph(2´´) in associated with aminoglucosides resistance in Staphylococcus coagulase-negative strains isolates from one neonatal unit in Bogota

Antecedentes. La causa más común de resistencia a antibióticos aminoglucósidos en bacterias Gram positivas, especialmente en S. epidermidis, es la enzima modificante AAC(6’)-APH(2"), capaz de acetilar y fosforilar un amplio rango de antibióticos. Objetivo. Determinar la presencia del gen aac(6’)-aph(2") en cepas de Staphylococcus coagulasa negativa aisladas en infecciones neonatales, e investigar la concordancia con las pruebas de sensibilidad in-vitro.Material y métodos. Se determinó la presencia del gen aac(6’)-aph(2") en 63 cepas de estafilococos coagulasa negativa provenientes de hemocultivos y puntas de catéter, de la Unidad de Neonatología del Instituto Materno Infantil, en Bogotá. Resultados. Staphylococcus epidermidis fue el germen más frecuente y el gen aac(6’)-aph(2") estaba presente en 55 (87,3%) cepas; de éstas, 42 (73,4%) cepas provenían de hemocultivos y 13 (23,6%) cepas de punta de catéter. La susceptibilidad a gentamicina se determinó mediante concentración inhibitoria mínima y para amikacina por difusión en disco. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia del gen aac(6’)-aph(2") y la resistencia a gentamicina y amikacina. Conclusión. La presencia del gen aac(6’)-aph(2") de resistencia a aminoglucósidos es muy alta en cepas de Staphylococcus epidermidis. Diferencias en la expresión del gen pueden explicar parcialmente la falta de consistencia con las pruebas de susceptibilidad utilizadas en la clínica.

Background. The most common cause of resistance to aminoglucosides is the acetilation and phosphorilation of the antibiotic by the enzyme AAC(6’)APH(2"). Objetive. To determine the presence of the gene aac(6’)-aph(2") in strains of coagulase-negative Staphylococci isolated from infected neonates and to investigate the concordance with the susceptibility tests in-vitro. Materials and methods. the aac(6’)-aph(2") gene was determined in 63 coagulase-negative Staphylococci strains isolated from blood cultures and catheter tips obtained from the neonatal care unit at the Instituto Materno Infantil in Bogotá, Colombia. Results. Staphylococcus epidermidis was the most frequently identified microorganism. The aac(6’)-aph(2") gene was detected in 55 out of 63 strains (73,43%), 42 strains (87,5%) isolated from blood cultures, and 13 strains (23,6%) isolated from catheter tips. Susceptibility to gentamycin was determined by minimum inhibitory concentration, and susceptibility to amikacin by the disk diffusion antibiotic sensitivity test. There was no a significant statistical association between the presence of the gene and the microbial susceptibility to either gentamycin or amikacin. Conclusion. The presence of the aac(6’)-aph(2") gene in strains of Staphylococcus epidermidis is very high. Differences in the expression of the gene might explain some cases of inconsistency with the susceptibility tests.

Bodas de plata de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): [revisión] / Silver anniversary of the polymerase chain reaction (PCR): [review]

Invenciones verdaderamente revolucionarias han promovido el cambio de pensamiento y la manera de trabajar en el ámbito del laboratorio. Una de estas invenciones es la reacción en cadena de la polimerasa, la cual ha aportado de manera significativa al conocimiento científico. Las diferentes metodologías que aplican la reacción en cadena de la polimerasa han permitido a los investigadores manipular la información genética de los organismos, facilitando procedimientos como la clonación y la secuenciación, entre otros, lo cual agilizó significativamente los resultados del Proyecto Genoma Humano. Existe diversidad de variantes de la reacción en cadena de la polimerasa convencional. Este escrito tiene por objetivo presentar una revisión sobre el tema, especialmente sobre la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, debido a las ventajas que ofrece.