Karyotype abnormalities and their clinical significance in a group of chronic myeloid leukemia patients treated with hematopoietic stem cell transplantation

CONTEXT AND OBJECTIVE: Following hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), karyotyping is a valuable tool for monitoring engraftment and disease status. Few studies have examined the prognostic significance of karyotypes in patients who underwent HSCT for chronic myeloid leukemia (CML). The objective of this study was to evaluate the significance of pretransplantation cytogenetic status in relation to outcomes following HSCT in CML patients. DESIGN AND SETTING: Case series study at Instituto Nacional do Câncer (INCA), Rio de Janeiro, Brazil. METHODS: Cytogenetic analysis was performed by G banding on 39 patients treated with HSCT. RESULTS: Thirty-one patients were in the chronic phase and eight were in the accelerated phase. Prior to HSCT, additional chromosomal abnormalities on the Philadelphia (Ph) chromosome were found in 11 patients. The most frequent additional abnormality was a double Ph, which was observed in four cases. Following HSCT, full chimeras were observed in 31 patients (79.5 percent). Among these, 23 (82.3 percent) had presented Ph as the sole abnormality. Mixed chimeras were observed in seven patients, of which three had additional abnormalities. Only one case did not present any cytogenetic response. Five patients presented cytogenetic relapse associated with clinical relapse following HSCT. Twenty-seven patients are still alive and present complete hematological and cytogenetic remission. CONCLUSION: In our study, the presence of additional abnormalities was not associated with worse outcome and relapse risk. Also, no differences in survival rates were observed. Our study supports the view that classical cytogenetic analysis remains an important tool regarding HSCT outcome.

RESUMO CONTEXTO E OBJETIVO: Após o transplante de células tronco-hematopoéticas (TCTH), o cariótipo é uma ferramenta valiosa para monitorar o status do enxerto e da doença. Poucos estudos investigaram o significado prognóstico do cariótipo nos pacientes que se submeteram ao TCTH para leucemia mielóide crônica (LMC). O objetivo desse estudo foi verificar o significado dos achados citogenéticos pré-TCTH em pacientes portadores de LMC. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Série de casos. Instituto Nacional do Câncer (INCA), Rio de Janeiro, Brasil. METODOLOGIA: Foram realizados estudos citogenéticos por bandeamento G em 39 pacientes submetidos ao TCTH. RESULTADOS: Trinta e um pacientes estavam em fase crônica e oito em fase acelerada. Pré-TCTH, alterações cromossômicas adicionais ao cromossomo Philadelphia (Ph) foram observadas em 11 pacientes. A mais freqüente foi o duplo Ph observado em quatro casos. Após o TCTH, quimerismo total foi observado em 31 pacientes (79,5 por cento). Desses, 23 (82,3 por cento) apresentavam somente o cromossomo Ph. Quimerismo misto foi observado em sete pacientes, sendo três com alterações adicionais ao Ph. Um caso não apresentou resposta ao TCTH. Recaída citogenética associada com recaída clínica foi observada em cinco pacientes. Após o TCTH, 27 pacientes permanecem vivos e com remissão clínica e citogenética. CONCLUSÃO: Em nosso estudo a presença de alterações cromossômicas adicionais ao Ph, prévias ao TCTH, não foi associada com pior evolução, com risco de recaída, bem como não foi observada diferença entre as taxas de sobrevida. Nosso estudo sugere que a citogenética clássica permanece uma grande ferramenta no monitoramento do TCTH.

Uso simultâneo do método do polimorfismo conformacional de fita simples e da citometria de fluxo no aumento da eficácia da detecção de anormalidades do gene e da proteína p53 na leucemia mielóide crônica / Simultaneous use of the single strand conformation polymorphism method and flow cytometry for increasing the detection efficacy of abnormalities in the gene and p53 protein in chronic myeloid leukemia

A proteína p53 desempenha um importante papel no controle do ciclo de celular e reparo no DNA danificado. Em pacientes com leucemia de mielóide crônica (LMC) as mutações neste gene são encontradas em até 30% dos casos, especialmente na crise blástica (LMC-CB), sendo a detecção de alterações nesse gene ou proteína importantes na avaliação da evolução clínica da LMC. O sequenciamento de DNA é descrito como o método capaz de identificar as mutações do gene TP53, sendo, no entanto uma técnica complexa e dispendiosa, o que dificulta seu emprego em larga escala, sendo, atualmente, proposto a pesquisa da proteína p53 por métodos imunológicos e a técnica da reação em cadeia da polimerase seguida pelo estudo do polimorfismo conformacional de fita simples (PCR/SSCP). Métodos: Analisaram-se amostras de 72 pacientes com LMC: 54 de LMC em fase crônica (33 fase inicial ou LMC-FCi e 21 em fase crônica tardia ou LMC-FCtd), 7 em fase acelerada ou LMC-Ac e 11 em crise de blástica (LMC-CB). Foram realizados PCR para os exons 5-9 para posterior estudo pelo SSCP e a expressão de proteína de p53 foi feita por citometria de fluxo. Resultados: Na análise do PCR-SSCP, alterações de mobilidade eletroforética indicativa de mutação do gene de TP53 foi observado em 11/72 pacientes e a expressão da proteína p53 em 17/72 pacientes. O SSCP anormal foi visto em dois casos de LMC-FCi (exon 7), quatro LMC-FCt (um exon 7, um exon 8 e dois exons 8-9), um na LMC-FAc (exon 8) e quatro na LMC-CB (dois no exon 5, um no exon 6 e um no exon 8-9). Neste grupo, a proteína de p53 estava expressa sete casos (todas LMC-CB e AC e 2 LMC-FCtd), havendo correlação estatisticamente significativa entre os resultados dos dois métodos. Conclusões: Estes resultados sugerem que os dois métodos conjuntamente empregados podem aumentar a sensibilidade na detecção de anormalidades do gene e proteína p53 nos pacientes com LMC. A presença de SSCP anormal associado à expressão da proteína de p53 nas fases avançadas desta doença na maioria de casos, sugere que estes exames possam se empregados como indicadores de progressão para a LMC.

The p53 protein play an important role in the control of the cell cycle and DNA repair. In patients with chronic myeloid leukemia (CML) mutation in this gene were found in up to 30%, especially among those in blast crisis. At present, the only widely available technology that reliable detects and defines all mutations is DNA sequencing. However, the routine sequencing of the entire TP53 gene in all cases suggestive of mutation in the laboratorial routine is prohibitively costly, complex, and time consuming. To screen for TP53 abnormalities in CML patients, both p53 protein expression bay immunologic methods and single strand conformation polymorphism of polymerase chain reaction products (SSCP-PCR) is proposed. Methods: We report the results of an analysis of 72 samples from CML patients:54 in chronic phase :33 in initial phase (ICP-CML) and 21 in late phase (LCP-CML), 7 in accelerated phase (AP-CML) and 11in blast crisis (BC-CML). DNA structure for 5-9 exons of the TP53 gene were analyzed by PCR-SSCP and p53 protein expression by flow cytometry (CF). Results: By PCR-SSCP analysis, shifts in eletrophoretic mobility of the TP53 gene were detected in 11 out of CML patients and p53 protein expression in 17 out of 72 CML patients. The abnormal SSCP pattern were showed in two cases of ICP-CML (exon 7), four LCP-CML (one exon 7 and exon 8 and two exons 8-9), one in AP-CML (exon 8) and four in BC-CML (two in exon 5, one in exon 6 and one in exon 8-9). In this group, the p53 protein were express in 17 cases (all CB and AC of CML patients and 2 out of 5 LCP samples of CML patients) and the statistical analysis by qui-square test showed correlation between this two tests. Conclusions: These results suggest that the two methods together can increase the sensibility of screening for p53 abnormalities in CML patients. The presence of abnormal SSCP associated to the p53 protein expression in advanced phases of this disease in the most of cases, suggesting that these tests can be used as an indicator of progression of CML.

Chromosome 17 abnormalities and mutation of the TP53 gene: correlation between cytogenetics, flow cytometry and molecular analysis in three cases of chronic myeloid leukemia

Alterations involving the short arm of chromosome 17 (17p) during the progression of chronic myeloid leukemia (CML) have been described. This chromosomal region contains the tumor suppressor gene TP53 that may be an important factor in the evolution of this disease. In this study, we used flow cytometry and western blotting to assess p53 protein expression and single stranded conformational polymorphism to examine TP53 gene alterations in three patients with CML who showed alterations in 17p. Only the case with del(17)(p11) had p53 expression positive by flow cytometry and an abnormal migration pattern by SSCP analysis. The importance of the correlation between the results obtained with these techniques, as well as the clinical course of the patients, are discussed.

Estudo da expressão dos antígenos de superfície celular, CD25 e CD69 em linfócitos ativados por PHA e TPA e tratados com tapsigargina, trifluoperazina e ouabaína / Study of the expression of cell surface antigens, CD25 and CD69 on activated lymphocytes by PHA and TPA and treated with Thapsigargin, Trifluoperazine and ouabain

Neste trabalho estudados a ação de TG, TFP e OUA (substâncias conhecidas por alterar o fluxo iônico da célula) sobre a expressão de dois antígenos de membrana, o CD25 e o CD69, em células ativadas por PHA e por TPA. O CD25 é a cadeia alfa do receptor de II-2 que se expressa na membrana algumas horas após a ativação. O CD69, membro da família das selectinas é rapidamente expresso após a ativação. Além do PHA e TPA,outra substância que que por si só levou a expressão de CD25 e de CD69 foi a TG...Estes dados parecem indicar um possível papel para o CD69 também na morte celular. Nós verificamos que um mesmo sinal PHA pode levar a dissociação de resposta para a expressão de CD25 e CD69 em uma mesma célula. Os nossos resultados, aliados aos dados da literatura, demonstrem o envolvimento de diferentes vias de ativação conduzindo à proliferação, à citotoxicidade e provavelmente à morte celular e a possibilidade de que um mesmo estímulo seja capaz de ativar mais de uma dessas vias.

Estudo da expressão dos antígenos de superficíe celular, CD25 e CD69, em linfócitos ativados por PHA e TPA, e tratados com tapsigargina, trifluoperazina e ouabaína

Neste trabalho estudamos a ação de TG, TFP e OUA (substâncias conhecidas por alterar o "fluxo iônico" da célula) sobre a expressão de dois antígenos de membrana, o CD25 e o CD69, em células ativadas por PHA e por TPA. O CD25 é a cadeia do receptor de IL-2 que se expressa na membrana algumas horas após a ativação. O CD69, membro da família das selectinas, é rapidamente expresso após a ativação. Além do PHA e TPA, outra substância que por si só levou à expressão de CD25 e de CD69 foi a TG. Em células ativadas por PHA, TG promoveu um aumento na expressão destas moléculas; em células ativadas por TPA este efeito foi verificado sobre a expressão de CD25, não havendo modificação na expressão de CD69. Esta substância apresentou efeitos diversos sobre a proliferação e citotoxidade celular: inibiu a proliferação celular induzida por PHA, mas não por TPA; inibiu a citotoxcidade mediada por células NK em repouso, mas as células LAK mostraram-se mais resisitentes ao seu efeito. Estes resultados sugerem a existência de diferentes vias para a proliferação e para a expressão de CD25, demonstrando que a inibição da proliferação não está necessariamente relacionada com a presença de CD25; também demonstraram um mecanismo de citotoxidade distinto atuando em células NK em repouso e ativadas (LAK). Os efeitos de TFP inibindo a proliferação, de células ativadas por PHA E tpa, e a citotoxidade mediada por células NK e LAK, já são conhecidos. TFP também inibiu a expressão CD69 e de CD25 em células ativadas por PHA, excetuando a expressão de CD25, nas primeiras horas após estímulo. A última substância estudada foi a OUA, conhecida por inibir a proliferação celular de células ativadas por PHA e por TPA, e não interferir na citotoxidade de células NK e LAK. Nossos resultados mostraram que OUA inibiu a expressão de CD25, em células ativadas por PHA, OUA promoveu aumento na expressão de CD69; embora em células ativadas por TPA, OUA não tenha interferido no número de células expressando esta molécula, em momentos tardios OUA promoveu um aumento percentual na expressão de CD69 nestas células. A inibição de CD25 por OUA, em células ativadas por PHA, pode ser uma das justificativas para a inibição da proliferação nestas células; mas não se aplica à inibição da proliferação em células ativadas por TPA. Nós demonstramos que OUA inibiu a progressão da fase de G1 para a S. Já está descrito na literatura que a ativação linfocitária via CD69 leva a um aumento no c-myc. Dados do nosso laboratório demonstraram que células ativadas por PHA e tratadas com OUA também promovem um aumento de c-myc e levam a apoptose. Estes dados parecem indicar um possível papel para o CD69 também na morte celular. Nós verificamos que um mesmo sinal (PHA) pode levar a dissociação de resposta para a aexpressão de CD25 e CD69, em uma mesma célula. Os nossos resultados, aliados aos dados da literatura, demonstraram o envolvimento de diferentes vias de ativação conduzindo à proliferação, à citotoxidade e provavelmente à morte celular e a possibilidade de que um mesmo estímulo seja capaz de ativar mais de uma dessas vias.

In the present work the action of TG, TFP and OUA (substances known to alter ion fluxes) was studied with regard to the expression of two membrane antigens CD25 and CD69 in cells activated by PHA and TPA. CD25 is the a chain of the IL-2 receptor which is expressed hours after activation. CD69, a member of the selectin family is rapidly expressed following activation. Besides PHA and TPA, another substance TG was also capable of inducing the expression of CD25 and CD69. TG promoted an increase in the expression of these molecules on cells activated by PHA whereas cells activated by TPA showed an increase in CD25 with no modification of CD69 expression. This substance produced diverse effects on proliferation and cellular cytotoxicity, it inhibited cellular proliferation induced by PHA but not by TPA and inhibited NK cells cytotoxicity but LAK cells were more resistance to its inhibitory effect. These results suggest the existence of different signaling pathways for proliferation and CD25 expression, demonstrating that proliferation inhibition is not necessarily related to the presence of CD25, they also suggest distinct cytotoxic mechanism in resting and activated NK cells. The inhibitory effect of TFP on proliferation induced by PHA and TPA; and on cytotoxicity mediated by NK and LAK cells is already known. TFP also inhibited CD69 and CD25 expression on PHA-activated cells, with the exception of the expression of CD25 on the first hours after activation with remains unchanged. The last substance studied by us was OUA, known to inhibit cellular proliferation of following activation by PHA and TPA and not to interfere with NK and LAK cytotoxicity. Our results shown that OUA inhibited CD25 expression on PHAactivated cells but not on TPA. OUA produced an increase of CD69 expression on PHA-activated cells. However, although OUA did not interfere in the number of cells expressing this molecule it augmenting at latter times the percentage of cells expressing high levels of CD69. CD25 inhibition on PHA activated cells not clarify inhibition of TPA-activated cells. Our results demonstreted that OUA inhibited the progression from G1 to S phase in both cultures. It has been already described that lymphocyte activation via CD69 leady to an increase of c-myc. Data from our laboratory demonstrated that PHA activated cells treated with OUA also promoted an increase in c-myc leading to apoptosis. This results seem to indicated a possible role of CD69 in cell death. We have seem that the same stimulus (PHA) may produce in the same cell a dissociated response with regard the expression of CD25 and CD69. Our results together with the datas from literature indicated the involvement of different activation pathways inducting to proliferation, cytotoxicity and cell death, and the possibility that the same stimulus may activate more than one pathway.