Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo / Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 10(8) cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico.

The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 10(8) cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis.

Evaluación de la presencia del gen mer A implicado en la detoxificación de mercurio a partir de actinomicetos nativos del humedal de La Conejera / Evaluation of the presence of mer A gen implied in the mercury detoxification from native actinomycetes of La Conejera wetland

Se aislaron diez cepas de actinomicetos nativos del humedal La Conejera a partir de muestras de sedimento y agua, con el fin de determinar la capacidad de resistencia y detoxificación de mercurio, evaluando la presencia del gen mer A involucrado en el proceso. La prueba de resistencia fue realizada mediante un test de sensibilidad tomando concentraciones desde 3,68x10-3 mM hasta 10 mM de HgCl2. Se realizaron curvas de crecimiento de 192 h para las cepas resistentes al mercurio, en un medio suplementado con 0,01 mM y 0,05 mM de HgCl2, realizando una fermentación discontinua y midiendo el crecimiento por la técnica de peso seco. A partir de estos resultados se determinó un tiempo de adaptación de 24 h y una producción máxima de biomasa de 2,72 g·L-1 a la hora 72. Paralelamente, se realizó la secuenciación de los genes de resistencia al mercurio de Streptomyces lividans 1326, por medio del diseño de los oligonucleótidos capaces de amplificar el extremos 3’ del gen mer A, codificador de la enzima mercurio reductasa. Se optimizaron las condiciones de amplificación por PCR para obtener un producto amplificado de 686 pb aproximadamente. Finalmente, se realizó una electroforesis en campo pulsado comprobando la presencia de plásmidos en la cepa KH7 con tamaños aproximados de 50, 90 y 300 Kb, no integrados al cromosoma y posiblemente asociados a la resistencia presentada frente al metal.

Ten native actinomycete strains were isolated from water and sediment samples collected in La Conejera wet-lands to assess mercury resistance and detoxification ability for evaluating the presence of the mer A gene involved in that process. Sensitivity assays were performed using 3.68 x 10-3 mM to 10 mM HgCl2 concentrations. Growth curves were generated for each resistant strain after 192 h in discontinuous fermentation in medium supplemented with 0.01 mM and 0.05 mM HgCl2. Biomass growth was then measured by dry weight, maximum value (2.37 g·L-1) being obtained after 72 h. Primer pairs were designed based on the sequence encoding the mercury-reductase enzyme in Streptomyces lividans 1326. PCR conditions for amplifying that region were standardised. The mer A gene was identified in the KH7 strain, resulting in an amplified product of around 686 bp. The KH7 strain electrophoresis profile obtained by pulsed field gel electrophoresis showed 50, 90 and 300 Kb plasmid DNA which could be related to metal resistance in this strain.