ABSTRACT
Objetivo. Describir un protocolo estandarizado mediante citometría de flujo para cuantificar en términos absolutos y relativos distintas subpoblaciones celulares de médula ósea normal y analizar la expresión de diferentes marcadores celulares específicos de linaje cuya reactividad está asociada a la diferenciación celular para ser usado como parte del control de calidad de rutina en los laboratorios de citometría. Materiales y métodos. El análisis inmunofenotípico de distintas subpoblaciones celulares se realizó en muestras de MO normal empleando un panel de anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para la caracterización fenotípica de leucemias agudas en 4 fluorescencias distintas, con un protocolo que combina marcaje celular de antígenos de membrana y de citoplasma. El análisis de expresión se realizó en términos de intensidad media de fluorescencia. Para el cálculo de recuentos absolutos se adicionaron esferas fluorescentes de concentración conocida. Resultados. El panel de anticuerpos utilizado permitió la identificación y cuantificación de las distintas subpoblaciones leucocitarias normales de origen linfoide y mieloide incluyendo células precursoras CD34+, y poblaciones celulares más diferenciadas incluidas en las líneas granulocítica, monocítica y eritroide. Se establecieron los valores de referencia de las poblaciones celulares y los rangos de expresión de los diferentes marcadores celulares importantes como parte del control de calidad de rutina en los laboratorios de citometría. Conclusión. Los patrones inmunofenotípicos identificados y la determinación de los valores absolutos y relativos de referencia de las distintas poblaciones leucocitarias normales en MO podrán ser utilizados por los laboratorios de citometría como modelo para establecer parámetros de referencia en el análisis fenotípico de neoplasias hematológicas.
Objective. To describe a standardized flow cytometry protocol for the relative and absolute quantification of hematopoietic cell subpopulations from normal bone marrow, and to evaluate the expression of different lineage-specific cell markers with a reactivity associated to cell differentiation to be used as part of the routine quality control in cytometry laboratories. Materials and methods. The immunophenotypical analysis of different cell subpopulations was done with samples from normal bone marrow using a panel of monoclonal and polyclonal antibodies useful in the characterization of acute leukemias with four different fluorescences, by means of a protocol that combines cell labeling of membrane and cytoplasm antigens. Expression analysis was done in terms of mean fluorescence intensity (MFI). Fluorescent beads at a known concentration were added for calculating the absolute count of cells. Results. The antibody panel used allowed the identification and quantification of different normal leukocyte subpopulations of lymphatic and myeloid origin, including CD34+ stem cells and more differentiated cell populations in the granulocytic, monocytic, and erythroid cell lines. We established reference values for cell populations and cell marker expression ranges as part of routine quality control of cytometry laboratories. Conclusion. Immunophenotypic patterns identified as well as absolute and relative reference values for the different normal leukocyte populations from bone marrow can be used by cytometry laboratories as a basis for establishing reference parameters in phenotypic analyses of hematologic neoplasia.
Objetivo. Descrever um protocolo padronizado por citometria de fluxo para quantificar em termos absolutos e relativos diferentes subpopulações de células de medula óssea normal e analisar a expressão de diferentes marcadores celulares de linhagem específica, cuja reatividade é associada com a diferenciação celular para ser usado como parte do controle de qualidade de rotina nos laboratórios de citometria de fluxo. Materiais e métodos. A análise imunofenotípica das subpopulações de células foi realizada em amostras de MO normais utilizando um painel de anticorpos monoclonais e policlonais úteis para a caracterização fenotípica de leucemia aguda em quatro fluorescências, com um protocolo que combina rotulagem celular de antígeno de membrana celular e de citoplasma. A análise de expressão foi realizada em termos de intensidade média de fluorescência. Para calcular a recontagem absoluta foram adicionadas esferas fluorescentes de concentração conhecida. Resultados. O painel de anticorpos utilizado permitiu a identificação e quantificação das subpopulações de leucócitos normais de origem linfóide e mielóide incluindo as células precursoras CD34+, e populações de células mais diferenciadas incluídas nas linhas granulocítica, monocítica e eritróide. Foram estabelecidos os valores de referência das populações celulares e os intervalos de expressão dos diferentes marcadores celulares importantes como parte da rotina de controle de qualidade em laboratórios de citometria. Conclusão. Os padrões imunofenotípicos identificados e a determinação dos valores absolutos e relativos de referência das diferentes populações de leucócitos normais em MOM podem ser utilizados pelos laboratórios de citometria como um modelo para estabelecer parâmetros de referencia na análise fenotípica de neoplasias hematológicas.
ABSTRACT
Objetivo. El propósito de este estudio fue evaluar en pacientes con LBDCG la expresión de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-X L y de las proteínas pro-apoptóticas Bad y Bax y su asociación con la supervivencia. Materiales y métodos. Se analizaron biopsias de 28 pacientes con diagnóstico de LBDCG. La expresión de los reguladores apoptóticos se evaluó mediante western blot. La asociación entre la expresión de las proteínas y la supervivencia fue analizada mediante el método de Kaplan-Meier y la prueba log-rank. Resultados. Las proteínas Bcl-2, Bak, Bad y Bcl-xL se encontraron expresadas en el 78,8%; 71,4%; 64,3% y 50% de los casos de LBDCG respectivamente. No encontramos asociación entre la presencia de las proteínas o sus niveles de expresión y la supervivencia total. La presencia de las proteínas Bad y Bcl-xL se asoció con una mayor supervivencia libre de enfermedad (33,3% vs. 20,0%, p LR test= 0,003; 42,9% vs. 14,3%, p LR test= 0,03 respectivamente). Niveles altos de expresión de Bad y de Bcl-X L se asociaron con una supervivencia libre de enfermedad mayor (35,7% vs. 21,4%, p LR test= 0,012 y 42,9% vs. 14,3%, p LR test= 0,045 respectivamente). Conclusión. Dado que la expresión de la proteína Bad en los tumores se asoció con una mayor supervivencia libre de enfermedad, los pacientes con bajos niveles de expresión de esta proteína podrían ser beneficiados en un futuro con terapias orientadas a inhibir las moléculas anti apoptóticas Bcl-xL y Bcl-2 mediante el empleo de moléculas que se unen específicamente al dominio BH3.
Objective. Our purpose was to evaluate the expression of antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL, and pro-apoptotic proteins Bad and Bax and their association with survival, in patients with DLBCL. Materials and methods. We analyzed biopsies from 28 patients diagnosed with DLBCL. The expression of the apoptotic regulators was assessed by western blot. The association between protein expression and survival was analyzed by the Kaplan-Meier method and the log-rank test. Results. Bcl-2, Bak, Bad and Bcl-xL proteins were expressed in 78.8, 71.4, 64.3 and 50% of the DLBCL cases, respectively. We found no association between the presence of proteins or their expression levels and overall survival. Both Bad and Bcl-xL were associated with higher disease-free survival (33.3% vs. 20.0%, p LR test= 0,003; 42.9% vs. 14.3%, p LR test= 0.03, respectively). High expression levels of Bad and Bcl-xL were associated with a higher disease-free survival (35.7% vs. 21.4%, p LR test= 0.012 y 42.9% vs. 14.3%, p LR test= 0.045, respectively). Conclusion. Given that expression of the Bad protein in tumors was related to a higher disease-free survival, patients with low expression levels of Bad could be candidates in future therapies oriented towards the inhibition of the anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Bcl-2 by using molecules that bind specifically to the BH3 domain.
Objetivo. O objetivo deste estudo foi avaliar em pacientes com LBDCG a expressão das proteínas anti-apoptótica Bcl-2 e Bcl-X L e das proteínas pró-apoptóticas Bad e Bax e sua associação com a sobrevivência. Materiais e métodos. Foram analisadas biópsias de 28 pacientes com diagnóstico de LBDCG. A expressão de reguladores de apoptose foi avaliada por Western blot. A associação entre a expressão das proteínas e a sobrevivência foi analisada pelo método de Kaplan-Meier e o teste log-rank. Resultados. As proteína Bcl-2, Bak, Bad e Bcl-xL foram expressas em 78,8%, 71,4%, 64,3% e 50% dos casos de LBDCG, respectivamente. Nós não encontramos associação entre a presença das proteínas ou de seus níveis de expressão e a sobrevivência total. A presença das proteínas Bad e Bcl-xL foi associada à maior sobrevivência livre da doença (33,3% vs. 20,0%, p LR teste= 0,003; 42,9% vs. 14,3%, p LR teste= 0,03, respectivamente). Altos níveis de expressão de Bad e de Bcl-X L foram associados com uma sobrevivência livre da doença maior (35,7% vs. 21,4%, p LR teste= 0,012 e 42,9% vs. 14,3%, p LR teste= 0,045, respectivamente). Conclusão. Uma vez que a expressão da proteína Bad em tumores foi associada com uma maior sobrevivência livre de doença, os pacientes com baixos níveis de expressão dessa proteína poderiam ser beneficiados num futuro com terapias orientadas a inibir as moléculas anti-apoptóticas Bcl-xL e Bcl-2 utilizando moléculas que se ligam especificamente ao domínio BH3.