Metilación de genes supresores tumorales en pacientes venezolanos con cáncer colorrectal: relación con estadio clínico de la enfermedad / Relationship of Methylation of Tumor Suppressor Genes with Clinical Stage of Colorectal Cancer in Venezuelan Patients

Resumen El cáncer colorrectal es una enfermedad heterogénea, en cuya aparición se involucran factores hereditarios y ambientales. En las formas heredadas existen genes responsables de incrementar el desarrollo tumoral en los portadores, y se consideran a los factores medioambientales como responsables de gran parte de las formas esporádicas. El objetivo de este estudio fue analizar el estado de metilación de 5 genes implicados en la carcinogénesis colorrectal y su relación con los distintos estadios clínicos de estos tumores. Por una parte, nuestro análisis reveló que el estado de metilación de los promotores de los genes HMLH1 (human mut homologue 1), APC (adenomatous poliposis coli), P15, P16 y CDH1, considerados como unas de las alteraciones más tempranas en este proceso; fluctuaron entre 13,3 % para hMLH1 y 56,6 % para APC. También reveló que la inactivación epigenética de los genes APC y P16 podrían ser responsables de la aparición y de la progresión de los tumores ya que se encontraron en pacientes con estadio II. Por otra parte, los genes APC y p15 resultaron estar mutados en todas las etapas de la carcinogénesis, por lo que se involucrarían en todos los procesos tanto de inicio como de invasión y metástasis. Por último, nuestros resultados apoyan la utilización de la identificación de la metilación de los genes supresores ya que se están identificando dianas epigenéticas para el desarrollo de nuevos tratamientos de quimioterapia y está emergiendo como una estrategia con gran potencial dado que, en principio, las alteraciones epigenéticas son potencialmente reversibles.

Abstract Colorectal cancer is a heterogeneous disease which involves hereditary and environmental factors. The inherited forms have genes which are responsible for increasing the tumor development in carriers. Environmental factors are considered responsible for many sporadic forms. The objective of this study was to analyze the methylation status of five genes involved in colorectal carcinogenesis and their relationships with the various clinical stages of these tumors. Our analysis revealed that the methylation status of the promoters of genes HMLH1, APC, P15, P16 and CDH1, considered to be among the earliest alterations in this process, ranged from 13.3% for HMLH1 to 56.6% for APC. In addition, epigenetic inactivation of APC and P16 genes could be responsible for the appearance and progression of tumors since inactivation was found in stage II patients. On the other hand, the APC and p15 gene were mutated in all stages of carcinogenesis, so they could be involved throughout the processes of initiation, invasion and metastasis. Finally, our results support using identification of methylation of suppressor genes since they identify epigenetic targets for development of new chemotherapy treatments. This is emerging as a strategy with great potential since epigenetic alterations are, in principle, potentially reversible.

Metilación de genes supresores de tumores en pacientes venezolanos con leucemia linfoide aguda / Methylation of tumor suppressor genes in Venezuelan patients with acute lymphoid leukemia

La leucemia linfoide aguda (LLA) es la neoplasia maligna hematológica más común en niños. Se ha podido demostrar un perfil específico de metilación de islas CpG en las regiones promotoras de genes supresores de tumor, que desempeña un papel crítico en el silenciamiento transcripcional y puede ofrecer nuevas opciones de tratamiento. Con el objetivo de determinar este perfil, se analizó el estado de metilación de las islas CpG de la región promotora de cuatros genes supresores de tumor asociados a diferentes etapas del proceso de carcinogénesis, dos p15 y p73 asociados a la regulación del ciclo celular y a la apoptosis y dos E-cadherin y RARβ2, involucrados en la migración y metástasis tumoral. Se analizaron 30 muestras de sangre periférica mediante modificación del ADN con bisulfito sódico y reacción en cadena de la polimerasa específica para metilación y se obtuvo en todos los pacientes, al menos la metilación de un gen (100%) y frecuencias específicas de metilación de 76,67% para el gen p73 (23 pacientes); 56,67% para el p15 (7 pacientes); 16,67% para el E-cadherin (5 pacientes) y 20,0% para el RARβ2 (6 pacientes). La frecuencia de metilación observada en los genes p15 y p73, sugiere el papel importante de esos genes en la patogenia de la LLA y su probable utilidad en el asesoramiento de riesgo y en la selección del tratamiento más adecuado.

Acute lymphocytic leukemia (ALL) is the most common hematologic malignancy in children. A specific methylation profile of CpG islands in the promoter regions of tumor suppressor genes has been demonstrated, which plays a critical role in transcriptional silencing and may offer new treatment options. In order to determine this profile, the methylation status of CpG islands was analyzed in the promoter region of four tumor suppressor genes associated with different stages of carcinogenesis: two associated with the regulation of cell cycle and apoptosis: p15 and p73; and two involved in migration and tumor metastasis: E-cadherin and RARβ2. Thirty peripheral blood samples were analyzed by modification of DNA with sodium bisulfite and chain reaction polymerase specific for methylation. In all patients, the methylation of at least one gene was observed (100%) and additionally, there were specific methylation frequencies of 76.67% for the p73 gene (23 patients); 56.67% for p15 (seven patients); 16.67% for E-cadherin (five patients) and 20.0% for the RARβ2 (six patients). The frequency of methylation observed in p15 and p73 genes suggests the important role of these genes in the pathogenesis of ALL and its usefulness in risk assessment and the selection of the most appropriate treatment.

CONTEO DE PLAQUETAS EN SUJETOS SANOS TRATADOS CON ANTIAGREGANTES PLAQUETARIOS / PLATELET COUNT IN HEALTHY SUBJECTS TREATED WITH ANTIPLATELET DRUGS

Se evaluó el recuento plaquetario en sangre periférica de sujetos sanos tratados con antiagregantes plaquetarios. Se analizaron 20 sujetos. Se distribuyeron en dos grupos: A: 10 sujetos que recibieron Aspirina (100 mg) y B: 10 con Clopidogrel (75 mg) por 7 días. Se les realizó recuento plaquetario en sangre periférica y en PRP. Encontrándose un conteo de plaquetas antes del tratamiento con antiagregantes en sangre periférica de 258,6 ± 54,46 x 109 l 7 días después de 254 ± 41,86 x 109 l (Aspirina), 285,4±70,92 y 196,5±37,90 x 109 l (Clopidogrel) respectivamente. En el PRP de los sujetos antes de recibir Aspirina fue 486,5 ± 129,54 x 109 l y después 449,2 ± 85,51 x 109 l; antes de la ingestión de Clopidogrel fue 565,2 ± 150,41 y 592,9 ± 203,46 x 109 l después del tratamiento. Se encontraron diferencias significativas solo para el conteo plaquetario en el grupo del Clopidogrel (p< 0.05). Se observó una disminución significativa del conteo plaquetario en sangre periférica posterior a la administración del Clopidogrel, posiblemente como consecuencia del mecanismo farmacológico del mismo. Son necesarios más estudios para evaluar un mayor número de individuos y medir mejor el efecto de los antiplaquetarios.

Platelet count in peripheral blood of healthy subjects with antiplatelet drugs. 20 subjects were analized. They were distributed in two groups: subject A: 10 who received aspirin (100 mg) and B:10 with Clopidogrel (75 mg) for 7 days. In all subjects studied platelet count in peripheral blood and PRP. It found a platelet count before treatment with antiplatelet agents in peripheral blood of 258,6 ± 54,46 x 109 l and 7 days after 254 ± 41,86 x 109 l (aspirin) and 285,4 ± 70, 196,5 ± 37,90 x 109 l (Clopidogrel) respectively. In the PRP of subjects before receiving aspirin was 486,5 ± 129,54 x 109 l and after 449,2 ± 85,51 x 109 l; prior to Clopidogrel ingestion was 565,2 ± 150,41 and 592,9 ± 203,46 x 109 l after treatment. Significant differences were found only for the platelet count in the Clopidogrel Group (p < 0.05). A significant decrease in platelet count was observed in peripheral blood after administration of Clopidogrel, possibly as a result of its pharmacological mechanism. More studies are needed to assess a greater number of individuals and better measure the effect of antiplatelet agents.

Utilidad del bandeo cromosómico con la enzima ALU I para la identificación de zonas metiladas en cáncer de mama / Utility of chromosome banding with ALU I enzyme for identifying methylated areas in breast cancer

El cáncer es un conjunto de trastornos que comparten la característica común de un crecimiento celular descontrolado, teniendo la facultad de comenzar en las células, generando dos procesos sucesivos: el aumento de la proliferación celular (tumor o neoplasia) y la capacidad invasiva de estas células, proliferando y colonizando otros tejidos (metástasis). La metilación del DNA es un proceso epigenético que recurrentemente ha sido involucrado como un factor importante en la patogenia de esta enfermedad el cual participa en la regulación de la expresión génica directamente al impedir la unión de factores de trascripción, e indirectamente propiciando la estructura “cerrada” de la cromatina. El objetivo de este trabajo fue determinar regiones hipermetiladas en muestras de extendidos cromosómicos mediante la utilización de la endonucleasa de restricción Alu I y relacionar estas regiones con sitios de localización de genes supresores de tumores relacionados con el cáncer de mama. Se analizaron 60 muestras de sangre periférica de mujeres con diagnóstico de cáncer de mama a las cuales se les realizó cultivo celular; los extendidos cromosómicos fueron teñidos con Giemsa previamente digeridos con la enzima Alu I. Se observaron cromosomas con regiones centroméricas y no centroméricas teñidas en el 37% de los casos, comprobándose que en el 95,46% de los casos existen genes asociados descritos, como metilados en cáncer de mama. Ejemplo de ellos son los localizados en los cromosomas 1q, 2q, 6q, y regiones centroméricas no teñidas usualmente como en los cromosomas 3, 4, 8, 13, 14, 15, y 17. Se sugiere la importancia de esta técnica ya que permite la visualización total del genoma, pudiendo localizar genes metilados relacionados con cáncer de mama y, de esta manera dirigir la terapia de forma específica, logrando una mejor respuesta terapéutica.

Cancer is a group of disorders characterized by uncontrolled cell growth which is produced by two successive events: increased cell proliferation (tumor or neoplasia) and the invasive capacity of these cells (metastasis). DNA methylation is an epigenetic process which has been involved as an important pathogenic factor of cancer. DNA methylation participates in the regulation of gene expression, directly, by preventing the union of transcription factors, and indirectly, by promoting the “closed” structure of the chromatine. The objectives of this study were to identify hypermethyled chromosomal regions through the use of restriction Alu I endonuclease, and to relate cytogenetically these regions with tumor suppressive gene loci. Sixty peripheral blood samples of females with breast cancer were analyzed. Cell cultures were performed and cytogenetic spreads, previously digested with Alu I enzyme, were stained with Giemsa. Chromosomal centromeric and not centromeric regions were stained in 37% of cases. About 96% of stained hypermethyled chromosomal regions (1q, 2q, 6q) were linked with methylated genes associated with breast cancer. In addition, centromeric regions in chromosomes 3, 4, 8, 13, 14, 15 and 17, usually unstained, were found positive to digestion with Alu I enzime and Giemsa staining. We suggest the importance of this technique for the global visualization of the genome which can find methylated genes related to breast cancer, and thus lead to a specific therapy, and therefore a better therapeutic response.

Utilidad del tripolifosfato de sodio en la tipificación de grupos sanguíneos y factor Rh en escolares / Usefulness of sodium tripoliphosphate in the classification of blood types and the Rh factor in school children

Los grupos sanguíneos son cada uno de los diversos tipos en que se han clasificado la sangre humana, basado en los componentes antigénicos presentes en la membrana de los glóbulos rojos, la sangre posee características específicas entre ellas la presencia o no del antígeno D (factor Rh), que es una proteína que se encuentra en la superficie del glóbulo rojo. El objetivo es determinar la utilidad del Tripolifosfato de Sodio (TPF) en la tipificación de grupos sanguíneos y factor Rh en escolares. El universo de estudio estuvo conformado por un grupo de 100 escolares mayores de 12 años, de ambos sexos a los cuales se les determinó el grupo sanguíneo y factor Rh por el método de aglutinación en tubo. Se obtuvo un 100% de correlación en ambas determinaciones (con TPF y sin anticoagulante) por lo que no se hallaron diferencias estadísticamente significativas con una (p<0,00001). El TPF puede ser recomendado como un anticoagulante para la realización de grupo sanguíneo, factor Rh y otras pruebas hematológicas, y para proyectar su eficacia como alternativa útil sustitutiva de otros de mayor costo convirtiéndose en un anticoagulante universal y único.

The blood types are each of the diverse groups into human blood cells, has been classified based on the antigenic components present in the red cells membrane, blood possesses specific characteristics, among them the presence or not of the antigen D (Rh factor), which is a protein found on the surface of the red cell. To determine the usefulness of (TPF) in the classification of blood types and the Rh factor in school children. The sample was made up of a group of 100 school children over 12 years of age, of both sexes, whose blood type and Rh factor were determined for the tube agglutination method. 100% correlation was obtained in both determinations (with TPF and without anticoagulant) therefore no statistically meaningful differences were found with a (p < 0,00001). The TPF maybe recommended as an anticoagulant for the determination of the blood type, Rh factor, and other haematological tests, and to suggestt its efficienct as a useful alternative to other, more expensive methods, becoming a unique and universal ancoagulant.

Anomalías cromosómicas en pacientes venezolanos con mieloma múltiple

Resumen. El estudio citogenético es un factor pronóstico fundamental en el estudio de mieloma múltiple (MM), puesto que, ha demostrado ser esencial para el asesoramiento genético en relación al diagnóstico, pronóstico y en cierta medida sugiere precozmente, el tratamiento más adecuado, hecho que representa una verdad aplicable a numerosas malignidades hematológicas. El objetivo de este trabajo fue identificar las anomalías cromosómicas en muestras de médula ósea (MO), obtenidas de pacientes con diagnóstico de MM. Los estudios cromosómicos se realizaron en cultivos de médula ósea, siguiendo la técnica descrita por Yunis en 1981; sin excepción, se llevaron a cabo previos a cualquier tratamiento con citostáticos. En la Unidad de Genética Médica de la Universidad del Zulia, se recibieron para estudio cromosómico, 22 muestras de MO, de las cuales 19 (86%) aportaron material adecuado, seis (32%) mostraron cariotipo normal, 13 (68%) anomalías cromosómicas numéricas y estructurales. De las anomalías observadas, 8 fueron numéricas (62%) y de ellas 3 casos (38%) correspondieron a hiperdiploidías, que involucraron los cromosomas 3, 5, 7, 15, 17, 18, 19. Cuatro casos (50%) mostraron hipodiploidías con pérdida de los cromosomas 8, 13, 16, 17, 18, X, Y, y se halló 1 caso de triploidía (12%). Cuatro casos correspondieron a anomalías estructurales (31%), como las deleciones 5p11, 11p14, 14q32, 17p11 y 1 caso presentó una combinación de anomalías tanto numérica como estructural (7%). El estudio demuestra la presencia de anomalías cromosómicas en la mayoría de los pacientes, los cuales presentan algunas diferencias con lo reportado en otras investigaciones.

Abstract. The cytogenetic study is an important prognostic factor in Multiple Myeloma (MM). The chromosomal analysis has demonstrated to be essential for the genetic advise in relation to the diagnosis, prognosis and might suggest precociously, the most appropriate treatment for the majority of hematological malignancies. The objective of this investigation was to identify the chromosomal abnormalities in samples of bone marrow (BM) from patients with diagnosis of MM. The chromosomal studies were carried out in BM cultures, following the technique described by Yunis. Without exception the analysis was carried out previous to any treatment with cytostatics. Twenty two samples of BM were received for chromosomal studies in the Unit of Medical Genetics of the University of the Zulia (UGM -LUZ). In 19 out of 22 samples (86%) appropriate material was obtained by cytogenetic analysis; 6 (32%) showed normal karyotype and 13 (68%) presented numeric and structural chromosomal abnormalities. Eight (62%) of the chromosomal anomalies detected were numerics, three cases (38%) with hyperdiploidy involving chromosomes 3, 5, 7, 15, 17, 18, 19 and four cases (50%) with hypodiploidy involving the chromosomes 8, 16, 17, 18, X and Y. Triploidy was found in one case (12%). Structural abnormalities were present in 4 cases (31%) such as deletions 5p11, 11p14, 14q32, 17p11 and 1 case (7%) presented structural and numeric anomalies. This study shows that the majority of patients with multiple myeloma have several chomosomal abnormalities with some differences from other reports.

Detección de portadoras de distrofia muscular Duchenne/Becker a través del análisis de loci STRs ligados al gen de la distrofina en familias venezolanas / Carrier Detection of muscular dystrophy Duchenne/Becker by analysis de STRs loci linked to the gene of the distrofina in venezuelan families

La Distrofia Muscular tipo Duchenne/Becker (DMD/DMB) es una enfermedad letal recesiva ligada al cromosoma X; el riesgo de recurrencia en una mujer portadora de DMD/DMB es de 50 por ciento de hijos sanos y 50 por ciento de hijos enfermos, 50 por ciento de hijas no portadoras y 50 por ciento de hijas portadoras, en cada gestación. El diagnóstico de DMD/DMB en una familia establece la necesidad de detectar a las mujeres portadoras con la finalidad de poder establecer el asesoramiento genético y el diagnóstico prenatal. El análisis de los polimorfismos de repeticiones cortas en tandem (STRs) localizados en los extremos 5, 3ïe intrones 44, 45, 49 y 50 del gen de la Distrofina se han utilizado para determinar los haplotipos en personas normales y en riesgo, a través de establecer el ligamiento genético entre el gen mutado y el haplotipo segregado. Se analizaron 105 individuos provenientes de 15 familias venezolanas con DMD/DMB, con uno o más afectados y 7 varones no emparentados. De los 105 individuos, 37 eran varones (26 afectados y 11 sanos) y 68 mujeres. Se amplificaron las secuencias STRs (STR44, STR45, STR49, STR 50 y STR3ïDYS) del gen de la distrofina por reacción en cadena de la polimerasa y se analizaron loa alelos polimórficos en los individuos estudiados. En 5/15 (33 por ciento) familias demostró la deleción de uno o varios exones. De las 68 mujeres, 27 (39,7 por ciento) resultaron portadoras, 27 (39,7 por ciento) no portadoras y en 14 (20,58 por ciento) no se pudo establecer un diagnóstico definitivo. En conclusión esta investigación pudo establecer el diagnóstico en 79,4 por ciento de las mujeres. Además en una familia se demostró que la mutación original ocurrió con el cromosoma X del abuelo materno, en otra se hizo el diagnóstico directo de portadora por hemicigosidad para el alelo mutado y en otra fue posible el diagnóstico prenatal. No se pudo excluir el mosaicismo germinal en 3 casos

Hallazgo citogenéticos en carcinoma ductal de mama / Cytogenetic findings breast ductal carcinoma

El carcinoma femenino de mama es un importante problema médico con implicaciones no solamente en salud sino también en la sociedad. A pesar de su gran importancia, poco es conocido acerca de los hallazgos cromosómicos de este tipo de cáncer y su relación con la clínica. Las anormalidades cromosómicas en algunas enfermedades malignas han sido usadas para diagnóstico y el pronóstico y para la localización de genes involucrados en patologías malignas. En este trabajo nosotros reportamos las anormalidades cromósomicas encontradas en 32 pacientes con carcinoma ductal primario de mama. En sólo uno de los tumores se observó un cariotipo normal, treinta y uno de ellos presentaron algún tipo de anomalía cromosómica, 21/32 (65,5 por ciento) correspondieron a normalidades del cromosoma 1 (trisomías, monosomías o anomalías estructurales como la t (1q;2p), y la del (1q42); otras anomalías observadas correspondieron a del (12p), del (4p), +7, +8, -7, -3. El significado de estos hallazgos y su papel en la tumorigénesis se hará más evidente a través del seguimiento estrecho de las pacientes que presentan este tipo de tumor y un cariotipo anormal

Diagnóstico prenatal II: importancia de los marcadores ecográficos en el diagnóstico prenatal de cromosomopatías / Prenatal diagnosis II: importance of the echosonographic markers in the prenatal diagnosis of chromosomophathies

En la Unidad de Genética Médica de la Universidad del Zulia (UGM-LUZ), desde enero 1993 hasta el presente, se viene desarrollando un Programa de Diagnóstico Prenatal (P-DxPN) donde se determinan los Factores de Riesgo Genético (FRG) de las parejas que solicitan asesoramiento genético prenatal y se realizan distintos procedimientos de DxPN que permiten el diagnóstico intrauterino de diferentes defectos congénitos. Uno de los procedimientos de DxPN utilizados es la Ecografía Fetal (EF). La EF es una técnica no invasiva de DxPN que permite el diagnóstico de gran parte de los síndromes dismorfogenéticos y en la actualidad, a través de la búsqueda de características específicas anormales fetales, pueden ser sospechadas algunas cromosomopatías. A estos hallazgos se les denomina "Marcadores Ecográficos de Cromosomopatías" (MEC). En un período de 3 años (enero 93-diciembre 96) han sido atendidos en el P-DxPN 321 gestantes y realizado 312 EF, resultando anormales 22 estudios, 17 con malformaciones fetales aisladas y 5 con MED que sugirieron el diagnóstico de alguna cromosomopatía específica. Sólo 1 feto con una cromosomopatía estructural (46,XX,21q-) no pudo sospecharse por EF. Los objetivos de este trabajo son: 1) Reportar 5 pacientes con marcadores ecográficos sugestivos de anormalidades citogenéticas y 2) Demostrar la utilidad de la EF en el DxPN de cromosomopatías. Estos reportes, nos hacen concluir que, la EF y la búsqueda de MEC, deben ser ofrecidas sistemáticamente a aquellas madres sin riesgos genéticos reconocibles, ya que son ellas las que representan el grupo mayoritario en cuanto a paridad y por ende, un número relativamente mayor de productos con defectos congénitos, de etiología cromosómica o no, los cuales en su mayoría pudieran detectarse por este método y permitir la selección de aquellas gestantes en quien se justificaría la práctica de métodos de DxPN invasivos

Diagnóstico prenatal I: programa de diagnóstico prenatal de la Unidad de Genética Médica de la Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela / Prenatal diagnostic I: prenatal diagnosis program at the medical Genetic Unit, University of Zulia, Maracaibo-Venezuela

La Unidad de Genetica Médica de la Universidad del Zulia (UGM-LUZ) cuenta con un Programa de Diagnóstico Prenatal (PDxPN) a través del cual se identificaron los Factores de Riesgo Genéticos (FRG) en las parejas que asisten a la consulta de Genética Prenatal, se aplican diferentes procedimientos de diagnóstico prenatal (DxPN) y se ofrece asesoramiento genético adecuado. El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados preliminares obtenidos en el lapso comprendido entre enero 93 y diciembre 96 y estimular a grupos afines a desarrollar programas similares. La muestra analizada fue de 321 gestantes a quienes se les determinó los FRG, tomando en cuenta el motivo y/o los antecedentes de la historia clínica genética. Los FRG fueron: Edad materna avanzada (EMA), hijo previo con anormalidad cromosómica (HAC), antecedente de malformaciones congénitas (AMC), antecedente de defectos de cierre del tubo neural (ADTN), antecedente de cardiopatía congénita (ACC), alguno de los padres portador de anormalidad cromosómica (PAC), aborto habitual (AH), anormalidad ecográfica fetal (AEF), niveles anormales de alfafetoproteína sérica materna (AFPSM), otros: exposición a agentes potencialmente teratogénicos, antecedente de enfermedades mendelianas, enfermedades sistémicas maternas y ansiedad materna o en su pareja. De acuerdo a los FRG se diseño el plan de DxPN, el cual contempló: Ecografía fetal (EF), ecocardiografía fetal (EcF), amniocentésis (ACT), cordocentésis (CCT) y/o determinación de niveles de AFPSM. El 70 por ciento de las gestantes presentó sólo un FRG, el 58,4 por ciento consultó en el 2do. trimestre de la gestación y la EMA fue el FRG más frecuente (40,3 por ciento) seguido de HAC, AEF, AMC, ACC, AH, ADTN, PAC, y de otros . Los procedimientos de DxPN fueron específicos y permitieron valorar el estado de salud del producto y el diagnóstico y permitieron valorar el estado de salud del producto y el diagnóstico de los anormales. La identificación de los FRG permitió ofrecer un plan de DxPN que dió respuesta a las necesidades de las parejas y demostró la utilidad de la aplicación de un Programa de DxPN integral y multidisciplinario dirigido a toda gestante con el fin de identificar las de alto riesgo genético