Comparison of techniques for corneal epithelium cell culture for the collection of conditioned medium / Comparação das técnicas de cultivo de células epiteliais da córnea para a coleta de meio condicionado

ABSTRACT Purposes: To determine the best protocol in obtaining the higher yield of conditioned culture medium to be used for the bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into corneal epithelial cells, five techniques for the primary culture of human corneal epithelial cells were evaluated. Methods: The studied culture techniques of corneal epithelial cells were: explants in culture flasks with and without hydrophilic surface treatment, on amniotic membrane, with enzymatic digestion, and by corneal scraping. The conditioned culture medium collected from these cultures was used to differentiate human bone marrow mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells, which were characterized using flow cytometry with pan-cytokeratin and the corneal-specific markers, cytokeratin 3 and cytokeratin 12. Results: The culture technique using flasks with hydrophilic surface treatment resulted in the highest yield of conditioned culture medium. Flasks without surface treatment resulted to a very low success rate. Enzymatic digestion and corneal scraping showed contamination with corneal fibroblasts. The culture on amniotic membranes only allowed the collection of culture medium during the 1st cell confluence. The effectiveness of cell differentiation was confirmed by cytometry analysis using the collected conditioned culture medium, as demonstrated by the expressions of cytokeratin 3 (95.3%), cytokeratin 12 (93.4%), and pan-cytokeratin (95.3%). Conclusion: The culture of corneal epithelial cell explants in flasks with hydrophilic surface treatment is the best technique for collecting a higher yield of conditioned culture medium to be used to differentiate mesenchymal stem cells.

RESUMO Objetivos: Foram estudadas cinco técnicas de cultivo primário de células epiteliais de córnea humana para se determinar o melhor protocolo para a obtenção do maior rendimento de meio de cultivo condicionado para ser utilizado na diferenciação de células tronco mesenquimais para células epiteliais de córnea. Métodos: As técnicas de cultivo estudadas foram: explantes em frascos de cultivo com e sem tratamento hidrofílico de superfície, sobre membrana amniótica, com digestão enzimática e por raspado de córnea. O meio de cultivo condicionado foi coletado e as células tronco mesenquimais induzidas a se diferenciarem em células epiteliais da córnea utilizando o meio de cultivo condicionado. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo com pan-citoqueratina e com os marcadores específicos da córnea, citoqueratina 3 e citoqueratina 12. Resultados: A técnica utilizando frascos com o tratamento de superfície apresentou o maior rendimento de meio de cultivo condicionado. Os frascos sem tratamento de superfície levaram a uma taxa de sucesso muito baixa. A digestão enzimática e a raspagem da córnea mostraram contaminação das culturas com fibroblastos de córnea. A cultura sobre membranas amnióticas só permitiu a coleta do meio de cultivo condicionado durante a 1ª confluência celular. A análise de citometria de fluxo confirmou o sucesso da diferenciação celular utilizando o meio de cultivo condicionado coletado, demonstrada pela expressão de citoqueratina 3 (95,3%), citoqueratina 12 (93,4%) e pan-citoqueratina (95,3%). Conclusão: O cultivo de explantes de células tronco mesenquimais em frascos com tratamento hidrofílico de superfície é a melhor técnica para a obtenção de um alto rendimento de meio de cultivo condicionado.

Ability of Allium cepa L. root tips and Tradescantia pallida var. purpurea in N-nitrosodiethylamine genotoxicity and mutagenicity evaluation

N-nitroso compounds, such as N-nitrosodiethylamine (NDEA), can be formed by the reaction of secundary amines with nitrosating agents, and are suspected to be involved in tumors in humans. NDEA has been considered a weak carcinogen in genotoxic assays probably due to the inefficient nitrosamine activation system that is used and/or to the efficient repair system. In this work, we evaluated the sensibility of Allium cepa L. root tips and Tradescantia stamen hair mutation assay (Trad-SH) using Tradescantia pallida var. purpurea for NDEA (0.1; 0.5; 5 and 25mM) genotoxicity and mutagenicity induction. Allium cepa L. was treated with different NDEA concentrations for 3h, for 3 consecutive days, including negative control (distilled water) and positive control maleic hydrazide (MH 30mg/mL). After treatment, the roots were hydrolyzed, squashed, and the mitotic index (MI) and cytological abnormalities were scored. The results revealed a cytostatic effect of NDEA (0.5 and 5mM), showing a significant reduction in the MI. Chromosome stickiness suggests a NDEA toxic effect. T. pallida purpurea did not respond to mutagens with a dose-dependent pattern. In conclusion, our study indicates that the root tips of Allium cepa L. have sensibility to detect NDEA genotoxicity, but not for Trad-SH test.

Nitrocompostos, como N-nitrosodietilamina (NDEA), podem ser formados pela reação entre uma amina secundária e agentes nitrosantes e são suspeitos de estarem envolvidos na formação de tumores em humanos. NDEA é considerada um carcinógeno fraco e ensaios genotóxicos provavelente pela utilização de um sistema de ativação ineficiente e/ou pela utilização de um eficiente sistema de reparo. Neste trabalho, nós avaliamos a sensibilidade de ensaios com Alliu cepa L. e Tradescantia pallida var. purpurea (Trad-SH) à genotoxicidade e mutagenicidade induzidas por diferentes concentrações de NDEA (0,1; 0,5; 5 e 25mM) por 3h, por 3 dias consecutivos, incluindo controle negativo (água destilada) e controle positivo, hidrazida maleica (MH 30mg/mL). Depois do tratamento, as raízes foram hidrolizadas, esmagadas e o índice mitótico (IM) e anormalidades citológicas foram contadas. Os resultados revelaram um efeito citostático de NDEA (0,5 e 5mM), pela significante redução do IM. Chromosome stickiness sugere um efeito citotóxico de NDEA. T pallida purpurea não respondeu ao mutágeno com um padrão dose dependente. Em conclusão, nossos estudos indicaram que raízes de Allium cepa L. possue sensibilidade na detecção genotóxica de NDEA, mas não para o ensaio Trad-SH.

Análise do cultivo de fibroblastos de pterígios primários e recidivados e da cápsula de Tenon normal / Fibroblasts from primary and recurrent pterygia and Tenon's capsule in cell culture

OBJETIVO: Avaliar a atividade proliferativa dos fibroblastos da cápsula de Tenon, provenientes de explantes de pterígios primários e recidivados e da conjuntiva normal. MÉTODOS: Foi realizado estudo prospectivo, randomizado, avaliando-se 43 pecas cirúrgicas, produto da exérese de 30 pterígios primários e 13 recidivados, além de fragmentos da cápsula de Tenon normal, obtida dos próprios portadores de pterígio. Foram avaliadas a taxa de proliferacão, migracão e confluência, analisadas segundo dados dos portadores como: idade, localizacão da lesão, tipo de lesão (tamanho, involutivo ou carnoso), primário ou recidivado. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística. RESULTADOS: Dentre os 30 pterígios primários cultivados, 70 por cento migraram e proliferaram e 60 por cento chegaram à confluência. A migracão, proliferacão e confluência iniciaram-se mais precocemente nas culturas de fibroblastos provenientes de pterígios em comparacão àquelas provenientes da Tenon normal. Os pterígios recidivados apresentaram migracão mais precoce que os primários. Não houve diferenca estatisticamente significativa quanto ao início da migracão, proliferacão e confluência entre os pterígios carnosos ou involutivos, assim como entre os pterígios de graus I-II e os de graus III-IV. CONCLUSAO: O cultivo celular de fibroblastos de pterígios é mais viável que o de Tenon normal. A migracão, proliferacão e confluência diferem em pterígios primários e recidivados. Pterígios carnosos e involutivos são semelhantes em cultura, assim como não existe diferenca entre os pterígios segundo o tamanho da lesão.

Polimorfismo do gene do receptor de insulina (INSR) em pacientes com síndrome dos ovários policísticos / Polymorphims of the insulin receptor gene (INSR) in patients with polycystic ovary syndrome

OBJETIVO: Avaliar a freqüência do polimorfismo do gene (INSR), localizado no éxon 17 do cromossomo 19, quanto ao seu envolvimento na predisposição genética da SOP e a associação com a sensibilidade à insulina e hiperandrogenismo. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudadas 57 pacientes com SOP e 50 mulheres normais com ciclos menstruais regulares (controle) quanto à frequência de polimorfismos de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polymorphisms–SNPs) do gene INSR, através da análise de comprimento do fragmento de restrição (Restriction Lengh Fragment Polymorphisms-RFLPs). Para avaliar a sensibilidade à insulina, utilizou-se os seguintes métodos matemáticos: relação glicemia/insulina de jejum (G/I), Homeostasis Model Assessment (HOMA) e Quantitative Sensitivity Check Index (QUICKI). Foram considerados normais, G/I maior ou igual a 4,5, HOMA menor que 3,8, e QUICKI maior ou igual a 0,34. RESULTADOS: O polimorfismo (C/T, T/T) na SOP não apresentou diferenças significativas com o grupo controle. Quanto a insulinemia, não observamos diferenças entre as pacientes com genótipos (C/T, T/T) e (C/C). CONCLUSÕES: As frequências do polimorfismo do gene INSR, são semelhantes tanto em pacientes com SOP, como em mulheres normais. Esses genótipos (C/T e T/T) não influenciam a sensibilidade à insulina e o hiperandrogeninsmo na SOP

The 3´-untranslated ApaI-Insulin-like Growth Factor II Gene (IGF2) Polymorphism in Women with Uterine Leiomyomas

OBJECTIVE: To explore a possible association betweenthe rare allele A of the single nucleotide polymorphismin the 3´-untranslated region of the insulin-like growthfactor II gene (IGF2), previously described as beingassociated with growth dysregulation, higher body massindex (BMI), and elevated risk of uterine leiomyomas.MATERIALS AND METHODS: A series of 144 women(72 clinically and histologically confirmed uterineleiomyomas and 72 without leiomyomas) was analyzedby a PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction – RestrictionFragment Length Polymorphism) based approach todetect a single nucleotide polymorphism in the 3´-untranslated region of the gene IGF2. Genotypic andallelic frequencies distributions in both groups werecompared with weight, height, and BMI. RESULTS: Nostatistically significant differences in the genotype andallelic frequencies between patients and controls wereobserved. Similarly, the distribution of genotypes andweight, height, and BMI did not differ significantlybetween the two groups although the weight and BMIwere lower in leiomyomas patients homozygous forallele A. CONCLUSIONS: The ApaI polymorphism ofthe IGF2 gene does not produce different risk forleiomyoma development. Our data suggest that thedeviations related in the genotypic frequencies for thispolymorphism among women with uterine leiomyomasis not correlated with BMI and that previous associationswere probably a result of chance statistical samplingpresent in a small studied group.

Identification and complete sequencing of novel human transcripts through the use of mouse orthologs and testis cDNA sequences

The correct identification of all human genes, and their derived transcripts, has not yet been achieved, and it remains one of the major aims of the worldwide genomics community. Computational programs suggest the existence of 30,000 to 40,000 human genes. However, definitive gene identification can only be achieved by experimental approaches. We used two distinct methodologies, one based on the alignment of mouse orthologous sequences to the human genome, and another based on the construction of a high-quality human testis cDNA library, in an attempt to identify new human transcripts within the human genome sequence. We generated 47 complete human transcript sequences, comprising 27 unannotated and 20 annotated sequences. Eight of these transcripts are variants of previously known genes. These transcripts were characterized according to size, number of exons, and chromosomal localization, and a search for protein domains was undertaken based on their putative open reading frames. In silico expression analysis suggests that some of these transcripts are expressed at low levels and in a restricted set of tissues.

Clonal chromosome abnormalites found in three non-neoplastic proliferative brain lesions

Chromosome analysis was made of brain lesions from three patients which, according to classical histopathological criteria, did not contain tumor cells. In addition to normal cells, we identified abnormal karyotypes with clonal numerical and structural chromosome alterations in at least two independently originated primary cultures from each lesion. Our data suggest that chromosomal aberrations can exist in vivo in non-neoplastic lesions. Other abnormalities may be due to genetic instability manifested only in vitro (culture artifacts) or may already have been present in brain tissue, reflecting previous chromosome damage (as a result of exposure to chemical treatment or enviromental clastogens).