Proteolytic activity in the adult and larval stages of the human roundworm parasite Angiostrongylus costaricensis

Angiostrongylus costaricensis is a nematode that causes abdominal angiostrongyliasis, a widespread human parasitism in Latin America. This study aimed to characterize the protease profiles of different developmental stages of this helminth. First-stage larvae (L1) were obtained from the faeces of infected Sigmodon hispidus rodents and third-stage larvae (L3) were collected from mollusks Biomphalaria glabrata previously infected with L1. Adult worms were recovered from rodent mesenteric arteries. Protein extraction was performed after repeated freeze-thaw cycles followed by maceration of the nematodes in 40 mM Tris base. Proteolysis of gelatin was observed by zymography and found only in the larval stages. In L3, the gelatinolytic activity was effectively inhibited by orthophenanthroline, indicating the involvement of metalloproteases. The mechanistic class of the gelatinases from L1 could not be precisely determined using traditional class-specific inhibitors. Adult worm extracts were able to hydrolyze haemoglobin in solution, although no activity was observed by zymography. This haemoglobinolytic activity was ascribed to aspartic proteases following its effective inhibition by pepstatin, which also inhibited the haemoglobinolytic activity of L1 and L3 extracts. The characterization of protease expression throughout the A. costaricensis life cycle may reveal key factors influencing the process of parasitic infection and thus foster our understanding of the disease pathogenesis.

Cisteína-proteinases em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis / Cysteine-proteinases in promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis

No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia) braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um picomajoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10 (elevado a -32) (miu)M de pNan/minuto) para cerca de 10(elevado a 10) parasitas, coincidente com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2(mais ou menos) 0,3(miu)M de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05(mais ou menos) 0,2(miu)M de pNan/minuto), e são inibidas por 10(miu)M E-64 (47por cento e 36por cento, respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa e 43kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas para os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63 kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas...intracelulares.