Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis

ABSTRACT: Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.

RESUMO: Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis / Expressão dos genes icaA e icaD na formação de biofilme em isolados de Staphylococcus aureus de mastite subclínica bovina

Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.(AU)

Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.(AU)

Epidemiological survey of Neorickettsia risticii in equids from the State of Rio de Janeiro, Brazil / Levantamento epidemiológico de Neorickettsia risticii em equídeos do Estado do Rio de Janeiro

Equine neorickettsiosis (EN), also known as Potomac Horse Fever, is a non-contagious disease caused by the bacterium Neorickettsia risticii of the Anaplasmataceae family. The objectives of this study were to detect the presence of anti-N. risticii antibodies by the indirect immunofluorescence assay (IFA) and of its DNA by qPCR in equids at high and low altitude regions in the State of Rio de Janeiro, Brazil, and to identify factors associated with seropositive equids by multiple logistic regression analysis. The frequency of anti-N. risticii antibodies was 16.05% (n=113/704). The animal age and breeding region were the factors that influenced the seropositivity rate for N. risticii in the equids (p<0.05). Equids from the lowland region had higher seropositivity (p<0.05; OR=5.87) compared to those of the mountain region. The presence of snails on the farm was a factor associated with this result (p<0.05; OR=2.88). In the lowland region, age of the animal and site of breeding were protective factors for the detection of antibodies anti-N. risticii in equids, with lower frequency of seropositivity in younger animals (p<0.05; OR=0.06) and in animals raised in dry areas (p<0.05; OR=0.22). The presence of the target DNA of N. risticii by qPCR was not observed in any of the samples tested. The existence of seropositive equids for N. risticii demonstrates a possible circulation of this agent in the studied area, and that the age related characteristics and equids breeding region are important factors regarding seropositivity in the State of Rio de Janeiro.(AU)

A Neorickettisiose equina (NE), também conhecida como Febre do Cavalo de Potomac, é uma doença não contagiosa causada pela bactéria Neorickettsia risticii da família Anaplasmataceae. Os objetivos deste estudo foram detectar a presença de anticorpos anti-N. risticii através da reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e do DNA dessa bactéria através da qPCR em equídeos de regiões de alta e baixa altitude no Estado do Rio de Janeiro, Brasil; e identificar os fatores associados com a soropositividade dos equídeos através da análise de regressão logística múltipla. A frequência de anticorpos anti-N. risticii foi de 16,05% (n=113/704). Observou-se que a idade e a região de criação foram os fatores que influenciaram a taxa de soropositividade para N. risticii nos equídeos (p<0,05). Equídeos da região de baixada apresentaram maior soropositividade (p<0,05; OR=5,87) quando comparado aos criados em região de montanha. A presença de caramujos na propriedade foi um fator associado a este resultado (p<0,05; OR=2,88). Na região de baixada, animais mais jovens (p<0,05; OR=0,06), criados em áreas secas (p<0,05; OR=0,22) demonstraram serem fatores de proteção na detecção de anticorpos anti-N. risticii. Não foi observada a presença do DNA-alvo de N. risticii através da qPCR em nenhuma das amostras testadas. A existência de equídeos soropositivos para N. risticii demonstra a possível circulação desse agente na área estudada, e as características inerentes a idade e a região de criação dos equídeos são fatores importantes relacionados à soropositividade no estado do Rio de Janeiro.(AU)

Reproductive efficiency of asymptomatic Theileria equi carriers mares submitted to an embryo transfer program / Eficiência reprodutiva de éguas portadoras assintomáticas de Theileira equi submetidas a um programa de transferência de embriões

This study aimed to assess and evaluate the effects of Theileria equi infection on embryonic recovery, gestation and early embryonic loss. Thirteen Mangalarga Marchador Theileria equi positive donors (diagnosed through nested-PCR) and 40 embryos receptors were used. Donors were submitted to two embryo collections in two consecutive estrous cycles (GId); after, the same mares were treated with imidocarb dipropionate (1.2mg/kg IM.) in order to collect more embryos in two more estrous cycles (GIId). Receptors were divided into two groups (control and with treated) with 20 animals each, where one group was the control (GIr) and the other one (GIIr) treated with 1.2mg/kg IM of imidocarb dipropionate assessing the gestation rate at 15, 30, 45 and 60 days. After 52 embryo collections, the embryonic recovery rates were 53.84% (14/26) and 65.38% (17/26) (p> 0.05) for GId and GIId, respectively. The gestation rate was 70% (14/20) (p>0.05) at 15, 30, 45 and 60 days in group GIr and for GIIr was 85% (17/20) (p>0.05) at 15 days, 80% (16/20) (p>0.05) at 30, 45 and 60 days. The treatment with imidocarb dipropionate did not cause significant improvement in the reproductive efficiency at an ET program.

Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da infecção por Theileria equi nas taxas de recuperação embrionária, gestação e perda embrionária precoce. Foram utilizadas 13 doadoras e 40 receptoras de embrião da raça Mangalarga Marchador, positivas para Theileria equi através da técnica de nested-PCR. Nas doadoras foram realizados duas coletas de embriões em dois ciclos estrais consecutivos (GId), em sequência, esses mesmos animais foram tratados com dipropionato de imidocarb (1,2mg/kg IM.) para realização de mais duas coletas de embriões em dois ciclos estrais (GIId). As receptoras foram divididas em dois grupos de 20 animais cada, onde um grupo foi o controle (GIr) e, o outro grupo, foi tratado (GIIr) com 1,2mg/ Kg IM de dipropionato de imidocarb, com intuito de avaliar a taxa de gestação aos 15, 30, 45 e 60 dias. Após a realização de 52 coletas de embrião, as taxas de recuperação embrionária foram de 53,84% (14/26) e 65,38% (17/26) (p> 0,05) para GId e GIId, respectivamente. A taxa de gestação foi de 70% (14/20) (p>0,05) aos 15, 30, 45 e 60 dias no grupo GIr e para o GIIr foi 85% (17/20) (p>0,05) aos 15 dias, 80% (16/20) (p>0,05) aos 30, 45 e 60 dias. O tratamento com dipropionato de imidocarb não promoveu melhora significativa na eficiência reprodutiva em um programa de TE.

Occurrences of anti-toxoplasma gondii and anti-neospora caninum antibodies in sheep from four districts of tocantins state, brazilian legal amazon region

Toxoplasmosis and neosporosis have been recognized as economically important diseases with considerable impact on the livestock industry. Little is known concerning the occurrence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sheep from Tocantins state, Brazil. Here, we investigated antibodies against these parasites and associated factors in 182 sheep from Araguaína, Santa Terezinha do Tocantins, Arguianópolis and Palmeiras do Tocantins districts, Tocantins. Sheep sera were assayed for T. gondii and N. caninum IgG antibodies by indirect fluorescence antibody test (IFAT), using cut-off point at a dilution of 1:40 and 1:25 respectively. The prevalence of seropositive animal for T. gondii was 13.74% and 13.74% for N. caninum. None of the characteristics studied including reproductive problems, presence of cats, presence of dogs and veterinary care (p>0.05) was associated with occurrence of T. gondii or N. caninum infection. Only breed was identified as associated factor for the occurrence of toxoplasmosis in sheep (p<0.05). The present study is the first report on serum occurrence of T. gondii and N. caninum in sheep from the state of Tocantins, Brazil.

Toxoplasmose e Neosporose são reconhecidas por doenças economicamente importantes com impacto considerável na indústria pecuária. Pouco se sabe sobre a ocorrência de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em ovelhas do estado do Tocantins, Brasil. Foram investigados a ocorrência de anticorpos contra estes parasitos e fatores associados em 182 ovelhas das cidades de Araguaína, Santa Terezinha do Tocantins, Arguianópolis e Palmeiras do Tocantins, Tocantins. Os soro das ovelhas foram testados para anticorpos IgG anti-T. gondii e anti-N. caninum pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), usando os pontos de corte na diluição de 1:40 e 1:25, respectivamente. A prevalência de animais soropositivos para T. gondii foi de 13.74% e para N. caninum, 13.74%. Nenhuma das características estudadas incluindo problemas reprodutivos, presença de gatos, presença de cães e cuidados veterinários (p>0.05) foram associadas com a ocorrência infecção por T. gondii ou N. caninum. Somente raça foi identificada como fator associado à ocorrência de toxoplasmose em ovelhas (p<0.05). O presente trabalho é o primeiro relato da ocorrência sérica de T. gondii e N. caninum em ovelhas do estado do Tocantins, Brasil.

Risk factors associated with the frequency of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle in southern Mozambique / Fatores de risco associados à frequência de anticorpos contra Babesia bovis e B. bigemina em bovinos da região sul de Moçambique

The study aimed to evaluate the risk factors associated with the frequency of IgG antibodies against Babesia bovis and B. bigemina in cattle in southern Mozambique. Eight hundred and nine serum samples were collected from cattle in three provinces namely Maputo, Gaza and Inhambane, and tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (i-ELISA) to assess the humoral immune response towards B. bovis and B. bigemina. The chi-square test at 5 percent significance was used to determine whether there was an association between gender, age and geographic origin of seropositive animals. The overall prevalence was 78.8 percent (548/695) for B. bovis and 76.0 percent (528/695) for B. bigemina. The origin of the animals showed a significant association (p<0.05) with seropositivity to both agents, while gender and age was not associated (p>0.05). Maputo province had the highest rate of positive animals, with 93.7 percent (118/126) for B. bovis and 97.6 percent (123/126) for B. bigemina. In Gaza province 77.3 percent (321/415) of the animals were positive for B. bovis and 67.5 percent (280/415) for B. bigemina, while in the province of Inhambane the levels of seropositivity were 70.8 percent (109/154) and 81.2 percent (125/154) for B. bovis and B. bigemina respectively. In the present study, the frequency of cattle positive for B. bovis and B. bigemina was shown to increase among older age groups, suggesting that infection and re-infection persisted even after the primary infection. Thus, this region is considered to be in a state of enzootic stability with regards to B. bovis and B. bigemina.

Foram avaliados os fatores de risco associados a frequência de anticorpos da classe IgG contra Babesia bovis e B. bigemina em bovinos da região sul de Moçambique. Oitocentos e nove amostras de soros foram coletadas de bovinos em três províncias nomeadamente Maputo, Gaza e Inhambane e testados por ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (i-ELISA) para avaliar a resposta imune humoral contra B. bovis e B. bigemina. O teste de Qui-quadrado a 5 por cento de significância foi utilizado para verificar a associação entre as variáveis sexo, faixa etária e origem geográfica com a soropositividade dos animais. A prevalência geral foi de 78,8 por cento (548/695) para B. bovis e 76,0 por cento (528/695) para B. bigemina. A origem dos animais apresentou associação (p<0,05) com a soropositividade a ambos os agentes, enquanto variável sexo não apresentou associação (p>0,05). A província de Maputo apresentou a maior taxa de animais positivos, com 93,7 por cento (118/126) para B. bovis e 97,6 por cento (123/126) para B. bigemina. Na província de Gaza a soropositividade foi de 67,5 por cento (280/415) para B. bigemina e 77,3 por cento (321/415) para B. bovis enquanto que na província de Inhambane a positividade foi de 81,2 por cento (125/257) e 70,8 por cento (109/257) para B. bigemina e B. bovis, respectivamente. Na presente pesquisa, a freqüência de bovinos positivos para B. bovis e B. bigemina aumentou nas faixas etárias superiores, sugerindo que as infecções e as re-infecções persistem mesmo após primo-infecção. A região estudada apresenta-se na condição de estabilidade enzoótica para os agentes estudados.

Características biológicas de Boophilus microplus (acari: ixodidae) a partir de infestação experimental em cão / Biological characteristics of Boophilus microplus (acari: ixodidae) on dog under experimental infestation

Boophilus microplus (Canestrini, 1887), um parasita comum dos bovinos, tem sido observado em cães. Com objetivo de descrever características biológicas desse parasitismo, um cão foi infestado experimentalmente com 10.000 larvas de B. microplus previamente mantidas em câmara climatizada a 27 ± 1 ºC e umidade relativa superior a 80 por cento. A média da fase parasitária foi de 24,4 ± 1,50 dias, com uma taxa de recuperação de 0,42 por cento. Das 21 fêmeas desprendidas natural e precocemente do hospedeiro, 6 (28 por cento) ingurgitaram o suficiente (75,1 ± 30,23mg) para realizar postura. O período médio de prépostura foi de 4,33 ± 1,37 dias e o período médio de postura de 9,17 ± 2,32 dias, com produção média de 18,78 ± 15,34mg de postura. O índice médio de produção de ovos observado foi de 22,38 por cento. Estes resultados demonstraram que fêmeas de B. microplus alimentadas em cão experimentalmente infestado, completam seu ciclo biológico. A obtenção de fêmeas, capazes de realizar posturas viáveis, sugerem a possibilidade do cão atuar como hospedeiro alternativo para B. microplus, especialmente quando não há disponível outra espécie de hospedeiro preferencial.

Boophilus microplus, a common parasite of cattle, has eventually reported in dogs. To describe biological features of this parasitism, one dog was experimentally infested with 10,000 larvae of B. microplus which were previously held in acclimatized camera at 27 ±1ºC and relative humidity up to 80 percent. The mean of parasitic phase was 24.4 ± 1.50 days, with 0.42 percent of recovery rate. Of 21 natural detached B. microplus females, six engorged enough (75.1 ± 30.23mg) to achieve posture. The mean period of pre-posture was 4.33 ± 1.37 days and the means period of posture was 9.17 ± 2.32, producing a mean of 18.78 ± 15.34 posture weight. The mean of eggs production index observed was 22.38 percent. The results showed that B. microplus females fed on dogs to complete their life cycle. The females collected were able to ovoposite viable eggs suggesting that dogs can be a possible alternative hosts to B. microplus, especially when there is no other preferential host species available.