Uso simultâneo do método do polimorfismo conformacional de fita simples e da citometria de fluxo no aumento da eficácia da detecção de anormalidades do gene e da proteína p53 na leucemia mielóide crônica / Simultaneous use of the single strand conformation polymorphism method and flow cytometry for increasing the detection efficacy of abnormalities in the gene and p53 protein in chronic myeloid leukemia

A proteína p53 desempenha um importante papel no controle do ciclo de celular e reparo no DNA danificado. Em pacientes com leucemia de mielóide crônica (LMC) as mutações neste gene são encontradas em até 30% dos casos, especialmente na crise blástica (LMC-CB), sendo a detecção de alterações nesse gene ou proteína importantes na avaliação da evolução clínica da LMC. O sequenciamento de DNA é descrito como o método capaz de identificar as mutações do gene TP53, sendo, no entanto uma técnica complexa e dispendiosa, o que dificulta seu emprego em larga escala, sendo, atualmente, proposto a pesquisa da proteína p53 por métodos imunológicos e a técnica da reação em cadeia da polimerase seguida pelo estudo do polimorfismo conformacional de fita simples (PCR/SSCP). Métodos: Analisaram-se amostras de 72 pacientes com LMC: 54 de LMC em fase crônica (33 fase inicial ou LMC-FCi e 21 em fase crônica tardia ou LMC-FCtd), 7 em fase acelerada ou LMC-Ac e 11 em crise de blástica (LMC-CB). Foram realizados PCR para os exons 5-9 para posterior estudo pelo SSCP e a expressão de proteína de p53 foi feita por citometria de fluxo. Resultados: Na análise do PCR-SSCP, alterações de mobilidade eletroforética indicativa de mutação do gene de TP53 foi observado em 11/72 pacientes e a expressão da proteína p53 em 17/72 pacientes. O SSCP anormal foi visto em dois casos de LMC-FCi (exon 7), quatro LMC-FCt (um exon 7, um exon 8 e dois exons 8-9), um na LMC-FAc (exon 8) e quatro na LMC-CB (dois no exon 5, um no exon 6 e um no exon 8-9). Neste grupo, a proteína de p53 estava expressa sete casos (todas LMC-CB e AC e 2 LMC-FCtd), havendo correlação estatisticamente significativa entre os resultados dos dois métodos. Conclusões: Estes resultados sugerem que os dois métodos conjuntamente empregados podem aumentar a sensibilidade na detecção de anormalidades do gene e proteína p53 nos pacientes com LMC. A presença de SSCP anormal associado à expressão da proteína de p53 nas fases avançadas desta doença na maioria de casos, sugere que estes exames possam se empregados como indicadores de progressão para a LMC.

The p53 protein play an important role in the control of the cell cycle and DNA repair. In patients with chronic myeloid leukemia (CML) mutation in this gene were found in up to 30%, especially among those in blast crisis. At present, the only widely available technology that reliable detects and defines all mutations is DNA sequencing. However, the routine sequencing of the entire TP53 gene in all cases suggestive of mutation in the laboratorial routine is prohibitively costly, complex, and time consuming. To screen for TP53 abnormalities in CML patients, both p53 protein expression bay immunologic methods and single strand conformation polymorphism of polymerase chain reaction products (SSCP-PCR) is proposed. Methods: We report the results of an analysis of 72 samples from CML patients:54 in chronic phase :33 in initial phase (ICP-CML) and 21 in late phase (LCP-CML), 7 in accelerated phase (AP-CML) and 11in blast crisis (BC-CML). DNA structure for 5-9 exons of the TP53 gene were analyzed by PCR-SSCP and p53 protein expression by flow cytometry (CF). Results: By PCR-SSCP analysis, shifts in eletrophoretic mobility of the TP53 gene were detected in 11 out of CML patients and p53 protein expression in 17 out of 72 CML patients. The abnormal SSCP pattern were showed in two cases of ICP-CML (exon 7), four LCP-CML (one exon 7 and exon 8 and two exons 8-9), one in AP-CML (exon 8) and four in BC-CML (two in exon 5, one in exon 6 and one in exon 8-9). In this group, the p53 protein were express in 17 cases (all CB and AC of CML patients and 2 out of 5 LCP samples of CML patients) and the statistical analysis by qui-square test showed correlation between this two tests. Conclusions: These results suggest that the two methods together can increase the sensibility of screening for p53 abnormalities in CML patients. The presence of abnormal SSCP associated to the p53 protein expression in advanced phases of this disease in the most of cases, suggesting that these tests can be used as an indicator of progression of CML.

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e imunocitoquímica / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and immunocytochemistry

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e na indução de apoptose em células geneticamente instáveis. A imunocitoquímica (ICQ) é um dos métodos preconizados para detecção e visualização dessa proteína no núcleo das células, sendo, no entanto um método demorado e trabalhoso o que dificulta a sua aplicação na rotina laboratorial. Atualmente, a citometria de fluxo (CF) também tem sido empregada na detecção da proteína p53 mutada ou estabilizada tendo a vantagem da praticidade e rapidez de execução. Objetivos e Metodologia: Comparar os resultados obtidos pela CF e ICQ na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamos amostras de 10 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA) 10 com leucemia linfóide crônica (LLC), tendo sido também empregadas, células de linhagens leucêmicas humanas que serviram como controle de expressão positiva e negativa para ambos os métodos além de linfócitos de 40 doadores de sangue. A CF e ICQ foram realizadas após a marcação com anticorpo monoclonal anti-p53 por técnicas convencionais. Resultados: Observamos concordância nos resultados da maioria das amostras dos pacientes e em todas as amostras das linhagens elulares tendo sido, no entanto constatados níveis de expressão mais elevados nas análises obtidos pela CF quando comparados com a ICQ, refletindo em uma maior sensibilidade desse método. Conclusão: Apesar da ICQ ser considerada uma técnica adequada para a detecção da p53, nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostras de células leucêmicas.

Introduction: The p53 protein plays a crucial role in the cell cycle control, DNA damage repair and induction of apoptosis in genetically unstable cells. The immunocytochemistry (ICQ) is one of the most common methodology for detection and visualization of this protein in the nucleus of the cells, but this technique is time-consuming and difficult to apply in the clinical setting. Nowadays the assessment of p53 protein expression by flow cytometry (FC) assays are easier to perform and provide reliable estimates of the prolonged half-life of mutant or inactivated wild-type p53 protein. Objectives and Methodology: Compare the results of p53 detection by FC and ICQ in leukemic cells. We used samples from 10 patients with acute lymphoid leukemia (ALL), 10 with chronic lymphoid leukemia (CLL). To positive and negative controls of p53 expression in both methods we also employed leukemic cells from human leukemic cell lines an lymphocytes from 40 healthy donors were also used as control for negative labeling in FC. The FC and ICQ were performed after labeling with p53 monoclonal antibody by the usual protocol. Results: We verified an agreement in the results in the majority of the leukemic cells from patients and in all human leukemic cell line samples. Conclusion: Despite of ICQ is considered a good methodology for p53 detection in leukemic cells; our results show that FC can be satisfactorily used for detection of this protein in leukemic cells.

Chromosome 17 abnormalities and mutation of the TP53 gene: correlation between cytogenetics, flow cytometry and molecular analysis in three cases of chronic myeloid leukemia

Alterations involving the short arm of chromosome 17 (17p) during the progression of chronic myeloid leukemia (CML) have been described. This chromosomal region contains the tumor suppressor gene TP53 that may be an important factor in the evolution of this disease. In this study, we used flow cytometry and western blotting to assess p53 protein expression and single stranded conformational polymorphism to examine TP53 gene alterations in three patients with CML who showed alterations in 17p. Only the case with del(17)(p11) had p53 expression positive by flow cytometry and an abnormal migration pattern by SSCP analysis. The importance of the correlation between the results obtained with these techniques, as well as the clinical course of the patients, are discussed.

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e Western blot / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and Western blot

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e naindução de apoptose em células geneticamente instáveis. O Western blot (WB) é o método preconizado paradetecção dessa proteína, no entanto é técnica demorada e trabalhosa. Atualmente, a citometria de fluxo (CF)também tem sido empregada na detecção da proteína p53 tendo a vantagem da praticidade. Objetivos e Metodologia:Comparar os resultados obtidos pela CF e WB na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamosamostras de 3 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA), 5 com leucemia mielóide aguda (LMA), 6 comleucemia mielóide crônica (LMC) e 8 com leucemia linfóide crônica (LLC). Os controles positivos (5) e negativos(4), para os dois métodos, foram linhagens de células leucêmicas. Juntamente com o controle de marcação negativa,na técnica de CF, utilizamos linfócitos de 40 doadores de sangue. A análise pela CF foi realizada após a marcaçãocom anticorpo monoclonal anti-p53 e o WB por técnica convencional. Resultados e Conclusões: Observamosconcordância nos resultados em 82 por cento das amostras leucêmicas e em 100 por cento nas linhagens celulares. CF+/WB+foram observados em pacientes com evolução desfavorável tais como na LLC / Síndrome de Richter, LMC emcrise blástica e na maioria das LMA. Apesar do WB ser considerado um método padrão para a detecção da p53,nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostrasleucêmicas.

Citometria de fluxo, imunocitoquimica e western blot na detecção da expressão da proteína p53 em células tumorais: uma análise comparativa / Flow cytometry, immunocytochemistry and western blot in measurement of p53 protein expression in tumor cells: a comparative analysis

Introdução e objetivos: p53 é a proteína cuja função é crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução de apoptose de células geneticamente instáveis. O Western Blot (WB) e a imunocitoquímica (ICQ) são atualmente os métodos de detecção mais empregados da proteína p53, se tratando, porém de técnicas de execução demorada e trabalhosa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia rápida para detecção e quantificação da proteína p53 em células tumorais através da citometria de fluxo (CF). Material e métodos:Empregou-se 14 linhagens de células tumorais humanas: Namalva, Raji e Daudi (linfoma de Burkitt), C91 e MT-2 (leucemia de células T do adulto), Jurkat (leucemia linfoblástica de células T), HL-60 (leucemia promielocítica), HT-29 (adenocarcinoma de colon), GLC-4 (carcinoma de pulmão), MCF-7 (carcinoma de mama), H460 e H460/bcl-2 (carcinoma de células não pequenas de pulmão), k562 e lucena (leucemia mielóide crônica em crise blástica) e C6 (astrocitoma originária de rato). Paralelamente, linfócitos provenientes de 36 indivíduos sadios serviram como controle da reação negativa. A iCQ foi realizada pelo método da imunoperoxidase indireta, a CF por marcação direta com anticorpo monoclonal anti-p53 diretamente conjugado ao isotiocianato de fluoresceína após permeabilização celular e o WB através do método padrão. A quantificação antigênica foi realizada através da média de intensidade de fluorescência na CF e densitometria no WB. Resultados: Observou-se uma correlação direta entre os resultados da CF, WB e ICQ, com expressão positiva nas linhagens Namalva, Raji, HT-29, GLC-4, MT-2, C91pl, MCF-7, H460 e H460/bcl-2 e negativa nas demais linhagens e em todas as células do grupo controle. A ICQ foi eficaz na demonstração da presença da p53 no núcleo da célula e a CF e WB permitiram também a quantificação antigênica, evidenciando células com variados níveis de expressão antigênica. A CF quando comparada ao WB apresentou maior sensibilidade. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a proteína p53 pode ser detectada em células tumorais através da CF. Esta metodologia é eficaz, sensível e prática, podendo ser empregada rotineiramente em estudos de expressão da proteína p53 em células tumorais.