Action of a pancreatin and an Aspergillus oryzae protease on whey proteins: correlation among the methods of analysis of the enzymatic hydrolysates

The objectives of this study were to hydrolyze whey proteins using a pancreatin and an Aspergillus oryzae protease; to evaluate the degree of hydrolysis (DH) and the peptide profile; and to establish the correlations among the analytical methods. Ten hydrolysates were prepared at different reaction times and the highest DH was obtained by the protein content method. Good correlations (r > 0.87) between the methods of formaldehyde and orthophthalaldehyde (OPA), formaldehyde and osmometry as well as osmometry and OPA were observed using pancreatin. Similar results were obtained between OPA and soluble protein content for the A. oryzae protease. The action of pancreatin produced the highest contents of di- and tripeptides (9.07, 7.12 and 6.46%) and the lowest of large peptides (42.43, 41.33 and 41.13%), after 3, 4 and 5 h of hydrolysis, respectively. Using pancreatin, the DH measured by formol titration and OPA was positively correlated with medium peptide content and negatively correlated with large peptide content. For the A. oryzae protease, a strong negative correlation was observed between the large peptide content and the DH measured by the OPA method.

Degree of hydrolysis and peptide profile of whey proteins using pancreatin / Grau de hidrólise e perfil peptídico das proteínas do soro de leite utilizando a pancreatina

In the present study, we used pancreatin for hydrolyzing whey proteins and evaluated the degree of hydrolysis (DH) and peptide size distribution. The following methods were used for DH determination: formol titration, soluble protein content, ortho-phthalaldehyde (OPA), and freezing point. Peptide size distribution was conducted by size-exclusion high-performance liquid chromatography (HPLC). The DH varied from 3.26% to 36.41%, and the highest yield was obtained by the soluble protein content method (mean of 35.85%). Formol titration was considered the most suitable method for assessing the DH, because it showed a marked increase with reaction time (from 1h-17.20% to 2h-24.86%). Significant positive correlation of strong intensity was observed between the following methods: formol titration and OPA (r=0.9616; p=0.0090), formol titration and freezing point (r=0.8784; p=0.0493), and OPA and freezing point (r=0.9515; p=0.0127). The highest contents of di- and tri-peptides and free amino acids were 9.07% and 8.22%, respectively. A significant positive correlation of strong intensity was also observed between the degree of hydrolysis and the fraction of medium-sized peptides by the formol titration (r =?0.9274; p=0.0232) and OPA (r=?0.8977; p=0.0386) methods.

En este trabajo, se utilizó una pancreatina para hidrolizar las proteínas del suero de leche, evaluándose el grado de hidrólisis (GH) y la distribución de tamaño de los péptidos. Los métodos de valoración con formol, determinación de proteínas solubles, ortoftalaldehído (OPA) y disminución del punto de congelación se emplearon para evaluar el GH. La distribución del tamaño de los péptidos se realizó por cromatografía líquida de exclusión molecular. El GH varió de 3,26% a 36,41% y los mejores resultados se obtuvieron con el método de determinación de proteínas solubles (media de 35,85%). La valoración con formol se consideró el método más adecuado para evaluar el GH, en función de los significativos incrementos con el tiempo de reacción (de 17,20% a 24,86%). Se observó una correlación positiva y de fuerte intensidad entre los siguientes métodos: valoración con formol y OPA (r=0,9616, p=0,0090); valoración con formol y disminución del punto de congelación (r=0,8784, p=0,0493); OPA con la disminución del punto de congelación (r=0,9515, p=0,0127). Los contenidos más altos de di-tripéptidos y de aminoácidos libres fueron de 9,07% y 8,22%, respectivamente. Una correlación positiva y de fuerte intensidad se verificó entre la fracción de péptidos medios y el GH evaluado con los métodos de la valoración con formol (r=?0,9274, p=0,0232) y OPA (r=?0,8977, p=0,0386).

Neste trabalho, uma pancreatina foi utilizada para hidrolisar as proteínas do soro de leite, avaliando-se o grau de hidrólise (GH) e a distribuição de tamanho dos peptídeos. Os métodos de titulação com formol, determinação de pro-teínas solúveis, ortoftalaldeído (OPA) e depressão do ponto de congelamento foram empregados para avaliar o GH. A distribuição do tamanho de peptídeos foi realizada por cromatografia líquida de exclusão molecular. O GH variou de 3,26% a 36,41% e os melhores resultados foram obtidos com o método de determinação de pro¬teínas solúveis (média de 35,85%). A titulação com formol foi considerada como o método mais adequado para avaliar o GH, em função dos significativos aumentos com o tempo de reação (de 17,20% a 24,86%). Observou-se uma correlação positiva e de forte intensidade entre os métodos de titulação com formol e OPA (r=0,9616, p=0,0090); titulação com formol e depressão do ponto de congelamento (r=0,8784, p=0,0493); OPA e depressão do ponto de congelamento (r=0,9515, p=0,0127). Os maiores teores de di-tripeptídeos e de aminoácidos livres foram de 9,07% e 8,22%, respectivamente. Correlação positiva e de forte intensidade foi verificada entre a fração de peptídeos médios e o GH avaliado pelos métodos da titulação com formol (r=?0,9274, p=0,0232) e OPA (r=?0,8977, p=0,0386).

Analysis of whey protein hydrolysates: peptide profile and ACE inhibitory activity

The aim of this study was to prepare enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate with a nutritionally adequate peptide profile and the ability to inhibit angiotensin-converting enzyme (ACE) activity. The effects of the type of enzyme used (pancreatin or papain), the enzyme:substrate ratio (E:S ratio=0.5:100, 1:100, 2:100 and 3:100) and the use of ultrafiltration (UF) were investigated. The fractionation of peptides was performed by size-exclusion-HPLC, and the quantification of the components of the chromatographic fractions was carried out by a rapid Corrected Fraction Area method. The ACE inhibitory activity (ACE-IA) was determined by Reverse Phase-HPLC. All parameters tested affected both the peptide profile and the ACE-IA. The best peptide profile was achieved for the hydrolysates obtained with papain, whereas pancreatin was more advantageous in terms of ACE-IA. The beneficial effect of using a lower E:S ratio on the peptide profile and ACE-IA was observed for both enzymes depending on the conditions used to prepare the hydrolysates. The beneficial effect of not using UF on the peptide profile was observed in some cases for pancreatin and papain. However, the absence of UF yielded greater ACE-IA only when using papain.

O objetivo deste estudo foi preparar hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite com perfil peptídico nutricionalmente adequado e com capacidade para inibir a atividade da enzima conversora da angiotensina (ECA). Os efeitos do tipo de enzima usado (pancreatina ou papaína), da relação enzima:substrato (E:S=0,5:100, 1:100, 2:100 e 3:100) e do uso da ultrafiltração (UF) foram investigados. O fracionamento dos peptídeos foi feito por CLAE de exclusão molecular e a quantificação dos componentes das frações cromatográficas foi realizada pelo método da Área Corrigida da Fração. A atividade inibitória da ECA (AI-ECA) foi determinada por CLAE de fase reversa. Todos os parâmetros testados afetaram tanto o perfil peptídico quanto a AI-ECA. O melhor perfil peptídico foi atingido para os hidrolisados obtidos com papaína, enquanto a pancreatina foi mais vantajosa em termos da AI-ECA. O efeito benéfico do uso de menor relação E:S sobre o perfil peptídico e a AI-ECA foi observado para ambas as enzimas dependendo das condições usadas para o preparo dos hidrolisados. O efeito benéfico da ausência da UF sobre o perfil peptídico foi observado em alguns casos para pancreatina e papaína. No entanto, a ausência da UF produziu maior AI-ECA somente quando a papaína foi usada.

Perfil peptídico de hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite, obtidos pela ação da pancreatina e da papaína / Peptide profile of enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate obtained by action of pancreatin and papain

The aim of this study was to obtain enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate with high oligopeptide, especially di- and tripeptides, and free amino acid contents, besides small amounts of large peptides. Different parameters were evaluated such as type of enzyme (pancreatin and papain), enzyme:substrate ratio (0.5:100, 1:100, 2:100 and 3:100), and the use of ultrafi ltration. The peptide profi les of the hydrolysates were characterized by using a fractionation method by size-exclusion HPLC followed by a rapid Corrected Fraction Area method for quantifying the components of the chromatographic fractions. The results showed that, in terms of number of analyzed samples, the pancreatin action was more advantageous than papain. However, the best peptide profile was obtained by papain, reaching 15.29% of di- and tripeptides, 47.83% of free amino acids and 25.73% of large peptides. The use of the smallest enzyme:substrate ratio (0.5:100) was beneficial in some cases for both enzymes, while the lack of ultrafiltration was favorable just for pancreatin.

El objetivo de este trabajo fue obtener hidrolizados enzimáticos a partir de concentrado proteico de suero lácteo con elevados contenidos de oligopéptidos, especialmente di y tri péptidos, y aminoácidos libres, además de reducida cantidad de grandes péptidos. Para eso fueron evaluados algunos parámetros como el tipo de enzima (pancreatina o papaína), la relación enzima:substrato (0,5:100, 1:100, 2:100 y 3:100)y el empleo de ultrafiltración. Para evaluar el perfil peptídico, los hidrolizados se sometieron a fraccionamiento en cromatografía líquida de alta eficiencia de exclusión molecular (SE-HPLC) y para la cuantificación de los componentes de las fracciones de la cromatografía fue utilizado el método del Área Corregida de la Fracción (ACF). Los resultados indican que el uso de pancreatina fue más ventajoso que el de papaína, así como la menor relación enzima:substrato (0,5:100). Por otro lado, el mejor perfil peptídico (15,29% de di y tripéptidos, 47,83% de aminoácidos libresy 25,73% de grandes péptidos) fue conseguido con el empleo de papaína. La menor relación enzima:substrato (0,5:100) fue favorable en algunos casos para las dos enzimas. La ausencia de ultrafiltración favoreció los hidrolizados producidos con pancreatina.

O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite com elevado teor de oligopeptídeos, principalmente di- e tripeptídeos, e de aminoácidos livres, além de quantidade reduzida de grandes peptídeos. Para tal, foram avaliados diferentes parâmetros, como tipo de enzima (pancreatina e papaína), relação enzima:substrato (0,5:100, 1:100, 2:100 e 3:100) e o emprego da ultrafiltração. Caracterizou-se o perfil peptídico pelo fracionamento dos hidrolisados por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular e, para a quantificação dos componentes das frações cromatográficas, empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração. Os resultados obtidos indicaram que, em termos de número de casos analisados, a ação da pancreatina foi mais vantajosa do que a da papaína. Entretanto, o melhor perfil peptídico foi obtido pela açãoda papaína, dando origem a 15,29% de di- e tripeptídeos, 47,83% de aminoácidos livres e 25,73% de grandes peptídeos. A utilização da menor relação enzima:substrato (0,5:100) foi benéfica em alguns casos para ambas as enzimas, enquanto que a ausência da ultrafiltração mostrou-se favorável apenas para a pancreatina.

Efeito da remoção de fenilalanina sobre o perfil peptídico de hidrolisados proteicos da farinha de trigo / Phenylalanine removal effect on the peptide profile of hydrolyzed protein from wheat flour

Para avaliar o efeito da remoção de fenilalanina no perfil peptídico dos hidrolisados proteicos de farinha de trigo, foram preparados nove hidrolisados empregando-se a associação sucessiva de pancreatina e de extrato enzimático bruto obtido da casca de abacaxi (EB). Foram testados o efeito da ordem de adição das enzimas, da temperatura de reação, da relação enzima: substrato (E:S) e do tratamento físico da amostra. A análise do perfil peptídico dos hidrolisados foi realizada em duas etapas: antes e após a remoção da fenilalanina. A cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular foi utilizada para efetuar o fracionamento e a quantificação dos peptídeos e aminoácidos livres pela técnica da Área Corrigida da Fração. O processo de remoção de fenilalanina melhorou o perfil peptídico de três hidrolisados, mas não afetou no de cinco hidrolisados. O efeito benéfico desse processo está associado ao aumento no teor de di- e tripeptídeos ou à redução na quantidade de peptídeos grandes. O melhor perfil peptídico foi obtido após a remoção de fenilalanina, utilizando-se pancreatina E:S de 4:100 a 50°C, durante 210 min, seguidade EB E:S de 10:100 a 70°C durante 90 min.

The effect of phenylalanine removal on the peptide profile of the protein hydrolysates from wheat flour wasinvestigated. Nine hydrolysates were prepared, using a successive association of a pancreatin and a crudeenzymatic extract obtained from pineapple peel (CE), and the effect of the order of enzymes addition, thereaction temperature, the enzyme: substrate (E:S) ratio, and the physical treatment of sample were examined.The analysis of peptide profile of hydrolysates was performed in two stages, that is before and after removingphenylalanine. The size-exclusion high performance liquid chromatography was used for performing the fractionation, followed by Correct Fraction Area technique for quantifying peptides and free amino acids. The process of phenylalanine removal improved the peptide profile of three hydrolyzed samples, but it did not affect the five hydrolysates. The beneficial effect of this process is correlated with the increase of di- and tripeptides contents, or in reducing the amount of large peptides. The best peptide profile was obtained after phenylalanine removal by using pancreatin at E:S ratio of 4:100 at 50ºC for 210min, followed by CE at E:S ratio of 10:100 at 70ºC for 90 min.