A Kunitz-type peptide from Dendroaspis polylepis venom as a simultaneous inhibitor of serine and cysteine proteases

Proteases play an important role for the proper physiological functions of the most diverse organisms. When unregulated, they are associated with several pathologies. Therefore, proteases have become potential therapeutic targets regarding the search for inhibitors. Snake venoms are complex mixtures of molecules that can feature a variety of functions, including peptidase inhibition. Considering this, the present study reports the purification and characterization of a Kunitz-type peptide present in the Dendroaspis polylepis venom as a simultaneous inhibitor of elastase-1 and cathepsin L. Methods: The low molecular weight pool from D. polylepis venom was fractionated in reverse phase HPLC and all peaks were tested in fluorimetric assays. The selected fraction that presented inhibitory activity over both proteases was submitted to mass spectrometry analysis, and the obtained sequence was determined as a Kunitz-type serine protease inhibitor homolog dendrotoxin I. The molecular docking of the Kunitz peptide on the elastase was carried out in the program Z-DOCK, and the program RosettaDock was used to add hydrogens to the models, which were re-ranked using ZRANK program. Results: The fraction containing the Kunitz molecule presented similar inhibition of both elastase-1 and cathepsin L. This Kunitz-type peptide was characterized as an uncompetitive inhibitor for elastase-1, presenting an inhibition constant (Ki) of 8 μM. The docking analysis led us to synthesize two peptides: PEP1, which was substrate for both elastase-1 and cathepsin L, and PEP2, a 30-mer cyclic peptide, which showed to be a cathepsin L competitive inhibitor, with a Ki of 1.96 µM, and an elastase-1 substrate. Conclusion: This work describes a Kunitz-type peptide toxin presenting inhibitory potential over serine and cysteine proteases, and this could contribute to further understand the envenomation process by D. polylepis. In addition, the PEP2 inhibits the cathepsin L activity with a low inhibition constant.(AU)

Kn-Ba: a novel serine protease isolated from Bitis arietans snake venom with fibrinogenolytic and kinin-releasing activities

Bitis arietans is a venomous snake found in sub-Saharan Africa and in parts of Morocco and Saudi Arabia. The envenomation is characterized by local and systemic reactions including pain, blistering, edema and tissue damage, besides hemostatic and cardiovascular disturbances, which can cause death or permanent disabilities in its victims. However, the action mechanisms that provoke these effects remain poorly understood, especially the activities of purified venom components. Therefore, in order to elucidate the molecular mechanisms that make the Bitis arietans venom so potent and harmful to human beings, this study reports the isolation and biochemical characterization of a snake venom serine protease (SVSP). Methods: Solubilized venom was fractionated by molecular exclusion chromatography and the proteolytic activity was determined using fluorescent substrates. The peaks that showed serine protease activity were determined by blocking the proteolytic activity with site-directed inhibitors. In sequence, the fraction of interest was submitted to another cycle of molecular exclusion chromatography. The purified serine protease was identified by mass spectrometry and characterized biochemically and immunochemically. Results: A serine protease of 33 kDa with fibrinogen-degrading and kinin-releasing activities was isolated, described, and designated herein as Kn-Ba. The experimental Butantan Institute antivenom produced against Bitis arietans venom inhibited the Kn-Ba activity. Conclusions: The in vitro activities of Kn-Ba can be correlated with the capacity of the venom to provoke bleeding and clotting disorders as well as hypotension, which are common symptoms presented by envenomed victims. Obtaining satisfactory Kn-Ba inhibition through the experimental antivenom is important, given the WHO's recommendation of immunotherapy in cases of human accidents with venomous snakes.(AU)

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), ao contrário da Escherichia coli comensal, adere, sinaliza e lesa enterócitos / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), instead of comensal Escherichia coli, adhere, signalize and damage enterocytes

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é importante causa de diarréia infantil em comunidades de baixa renda, onde, de maneira perversa, estão associados fatores como subnutrição, condições precárias de habitação, falta de água potável e de rede de esgotos. Biópsias do intestino de pacientes infectados com EPEC mostraram que as bactérias aderem à superfície do epitélio intestinal, na forma de microcolônias localizadas localized adhesion (L/A), e, na célula infectada, causam lesões típicas denominadas attaching and effacing (A/E). Essas lesões caracterizam-se por gerar, na face apical da célula, destruição das microvilosidades e formação do pedestal. Modelos in vitro, usando células epiteliais como alvo e diferentes cepas ou mutantes de EPEC como agente infectante, revelaram que a adesão da bactéria à célula ocorre em três estágios. O contato inicial entre EPEC e a célula hospedeira é mediado por pili formadores de feixes tipo IV (BFP) codificados por genes encontrados em plasmídios de 50 MDa a 70 MDa, EAF, EPEC adherence factor (EAF). Seguem-se estágios intermediários de deslocamento de proteínas efetoras da bactéria para a célula alvo, mediados por fatores tipo III (TTSS). Os genes necessários para a formação de A/E e do pedestal encontram-se dentro de uma ilha de patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (LEE). Durante este estágio, ocorrem transdução de sinais na célula hospedeira para ativação do sistema NF-kB, produção de mediadores da inflamação e apoptose. No estágio final, EPEC adere mais intimamente à célula epitelial. Essa aderência íntima é mediada pela interação entre uma proteína da membrana externa da bactéria, a intimina, e seu receptor Tir, translocado da bactéria para a superfície das células epiteliais. A interação intimina-Tir provoca rearranjo dos componentes do citoesqueleto - actina, talina e ezrina- na região da adesão da célula infectada. EPEC induz vigorosa e persistente produção de anticorpos em seres humanos que vivem em áreas endêmicas e em modelos animais imunizados com vetores que expressam fatores de virulência ou com as proteínas recombinantes purificadas. Essas observações reforçam as recomendações de organismos ligados à saúde pública sobre a importância da amamentação do recém-nascido com leite materno e do desenvolvimento de vacinas e anticorpos protetores para prevenção e tratamento de infecções causadas por EPEC.

C3: a versatile and multifunctional complement protein

The major complement component, C3, is the substrate for C3 convertases which emerge by activation of the classical and alternative complement pathways; fragments C3b and C3a are the resulting split products. The C3b becomes a constituent of the amplification C3-convertase in the alternative pathway, and of the C5 convertases responsible for the organization of the potentially cytolytic complex C5b-C9, being also able to interact with numerous serum proteins, cell surface molecules and foreign protein. The C3a functions as mediator of the early events of teh inflamatory process. Recent observations on the molecular features involved in the multiple interaction of C3 characterize this proteins as a most versatile and multifunctional molecule which is also an important participant of both the immune and monimmune surveillance mechanism

Controle de qualidade dos venenos animais e dos correspondentes antivenenos: I. Padronizaçäo dos métodos de ensaio das atividades bioquímicas e farmacológicas dos venenos de algumas espécies do gênero Bothrops e Crotalus ... / Quality control of animal venoms and of their correspondent antivenoms: I. Standardization of the assay methods to analise the biochemical and pharmacological properties of venoms from some snakes belonging to the genus Bothrops and Crotalus...

Para a avaliaçäo das atividades promotoras da coagulaçäo do fibrinogênio e do plasma e indutoras de edema, hemorragia, necrose e mortalidade presentes no veneno de algumas serpentes brasileiras (B.alternatus, B.atrox, B.cotiara, B.jararaca, B.jararacussu, B.moojeni, B.neuwiedi e crotalus durissus terrificus) foram padronizados métodos de ensaio. De cada espécie de serpente foram preparadas misturas homogêneas de venenos, o teor protéico determinado pelo método de Lowry et al.(6) e cada mistura dividida igualmente em duas amostras, uma sendo seca sob vácuo à temperatura ambiente (VS) e a outra liofilizada (VL), e ambas armazenadas a 20'C. O teor protéico foi da ordem de 1.0-1.5 mg/mg de veneno seco na maioria das espécies e da ordem de 0.8-0.85 mg/mg no veneno de B.cotiara. A atividade enzimática, medida pela proteólise da caseína, foi muito pronunciada nos venenos de B.atrox e B.moojeni, baixa no veneno de B.cotiara, intermediária no veneno das demais espécies do gênero Bothrops e praticamente indetectável no veneno de c.d.terrificus. As atividades hemorrágica e necrotizante, conquanto presentes no veneno de todas as espécies botrópicas, foram bastante elevadas no veneno de B.neuwied e ausentes no veneno de c.d.terrificus. Todos os venenos testados exibiram atividade edematogênica. A atividade promotora de coagulaçäo, embora presente em todos os venenos, foi mais alta nos venenos de B.atrox, B.cotiara e B. neuwiedi. A atividade letal, medida em termos de DL50, foi marcadamente elevada no veneno de c.d.terrificus e alta nos venenos de B.jararaca e B.neuwiedi em comparaçäo com os venenos das demais serpentes do gênero Bothrops. Em todos os ensaios as amostras de veneno VS e VL foram sempres testadas em paralelo. Conquanto as atividades enzimáticas e biológicas dos venenos näo se diferissem em ambas as amostras, o processo de liofilizaçäo deveria ser o método de escolha pelo fato de associar, durante o processo de secagem, congelaçäo e vácuo, condiçöes que presumivelmente preservariam melhor a configuraçäo molecular natural da maioria das proteínas

Produçäo de anticorpos antiveneno total de Crotalus durissus terrificus em cavalos por fosfolipase A2 / Antigens antivenom's total production of Crotalus durissus terrificus in horses by phospholipase A2

Fosfolipases A2 purificada de veneno de Crotalus durissus terrificus ou veneno integral foram usados, como antígenos, para imunizar cavalos e burros. A imunizaçäo de base foi feita injetando os animais, pela via subcutânea, com 5mg do antígeno emulsionado em adjuvante de Freund completo. Quatro meses depois, os animais foram reimunizados injetando-se os antígenos correspondentes, dissolvidos em salina, ao redor dos granulomas resultantes da imunizaçäo primária. Esta injeçäo foi repetida por mais cinco vezes a intervalos de uma semana..