Proliferation and differentiation of stem cells in contact with eluate from fibrin-rich plasma membrane / Proliferação e diferenciação de células-tronco em contato com eluato de membrana de fibrina

ABSTRACT Objective: To evaluate the ability of the eluate from fibrin-rich plasma (FRP) membrane to induce proliferation and differentiation of isolated human adipose-derived stem cells (ASCs) into chondrocytes. Method: FRP membranes were obtained by centrifugation of peripheral blood from two healthy donors, cut, and maintained in culture plate wells for 48 h to prepare the fibrin eluate. The SCATh were isolated from adipose tissue by collagenase digestion solution, and expanded in vitro. Cells were expanded and treated with DMEM-F12 culture, a commercial media for chondrogenic differentiation, and eluate from FRP membrane for three days, and labeled with BrdU for quantitative assessment of cell proliferation using the High-Content Operetta® imaging system. For the chondrogenic differentiation assay, the SCATh were grown in micromass for 21 days and stained with toluidine blue and aggrecan for qualitative evaluation by light microscopy. The statistical analysis was performed using ANOVA and Tukey's test. Results: There was a greater proliferation of cells treated with the eluate from FRP membrane compared to the other two treatments, where the ANOVA test showed significance (p < 0.001). The differentiation into chondrocytes was visualized by the presence of mucopolysaccharide in the matrix of the cells marked in blue toluidine and aggrecan. Conclusions: Treatment with eluate from FRP membrane stimulated cell proliferation and induced differentiation of the stem cells into chondrocytes, suggesting a potential application of FRP membranes in hyaline cartilage regeneration therapies.

RESUMO Objetivo: Avaliar a capacidade do eluato proveniente da membrana de plasma rico em fibrina (PRF) de induzir proliferação e diferenciação das células-tronco humanas isoladas de tecido adiposo (CTDAh) em condrócitos. Método: As membranas de PRF foram obtidas por centrifugação de sangue periférico de dois indivíduos saudáveis, cortadas, colocadas em poços de placa de cultivo por 48 h para obtenção do eluato de fibrina. As CTDAh foram isoladas do tecido adiposo por digestão com solução de colagenase e expandidas in vitro. As células foram expandidas e tratadas com meio de cultivo DMEM-F12, meio comercial para diferenciação condrocítica, e eluato de fibrina durante três dias e marcadas com BrdU para avaliação quantitativa da proliferação celular com o uso do sistema de imagens High-Content Operetta®. Para o ensaio de diferenciação condrogênica, as CTDAh foram cultivadas em micromassa por 21 dias e coradas com azul de toluidina e agrecana para avaliação qualitativa em microscópio óptico. As avaliações estatísticas foram feitas por meio dos testes Anova e Tukey. Resultados: Houve uma maior proliferação das células tratadas com o eluato de fibrina comparativamente com os outros dois tratamentos, nos quais o teste Anova apontou significância (p < 0,001). A diferenciação em condrócitos foi visualizada pela presença de mucopolissacarídeos na matriz das células tratadas com meio de diferenciação ou eluato e marcação positiva para agrecana. Conclusões: O tratamento com o eluato da membrana de fibrina estimulou a proliferação celular e induziu a diferenciação das células-tronco em condrócitos, o que sugere uma potencial aplicação da membrana de PRF nas terapias de regeneração de cartilagem hialina.

Avaliação preliminar dos efeitos da lidocaína sobre a membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) / Preliminary analysis of chorioallantoic membrane of chick embryo (CAM) toxicity induced by lidocaine

Esse estudo avaliou os efeitos da Lidocaína (anestésico local) sobre a membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM). Os modelos experimentais mais utilizados para avaliação de substâncias químicas necessitam de um longo tempo de experimentação, alto custo e inúmeras implicações éticas. Muitos autores consideram a CAM viável, pois minimiza a dor e o sofrimento das cobaias além de apresentar respostas teciduais semelhantes àquelas observadas em mamíferos, com a vantagem da exclusão de procedimentos cirúrgicos e visualização constante do sítio de implante. Objetivo: Avaliar a resposta da CAM frente à lidocaína e verificar os efeitos sobre os embriões. Método: O anestésico foi aplicado (0,5; 1; 2; 5 e 10 μg / ml) através de uma abertura feita na casca, sobre gel fisiológico (0,5 ml) posicionado sobre a CAM de ovos com seis dias de incubação. Após sete dias os ovos foram reabertos, observados com microscópio estereoscópico e fotografados em nível macroscópico. Após, avaliamos o número de vasos da membrana através da sobreposição digital de uma grade nas fotografias. As membranas foram retiradas e coradas (H&E e Tricrômico de Masson) para a análise histológica. Resultados: a Lidocaína não provocou efeitos sobre o número de vasos na CAM, mas as observações macroscópicas e microscópicas demonstraram a presença de colágeno. Também foi observada má formação da parede ventral, do bico, das asas e dos dedos dos embriões. Conclusão: Preliminarmente, de acordo com esse protocolo experimental a Lidocaína não teve efeitos pró- ou antiangiogênicos, mas parece provocar distúrbios no processo de reparação tecidual, além de desencadear alterações morfológicas nos embriões...

The goal of this study was to evaluate the response of the chorioallantoic membrane of chick embryo (CAM) to Lidocaine (local anesthetic) and observe its effect on the embryo. Some authors has considered the experimental model of CAM viable, because their tissue responses similar to those observed in mammals. Methods: For the assays (n=8), the eggs were cleaned and a window was opened in the eggshell for access to CAM. All eggs were kept in a humidified incubator at 37°C and gently agitated manually twice a day. The implants with the Lidocaine (0.5, 1, 2, 5 and 10 μg / ml) were performed on gel saline (0.5 ml) previously positioned on the CAM of fertile eggs with six days of incubation. After seven days the eggs were reopened to the observation on stereoscopic microscope. The samples were photographed and later, removed for subsequent processing and histological analysis (HE and Masson trichrome). We also evaluated the number of blood vessels and pro- or antiangiogenic response of CAM. The counting was made using a software (Image- Pro Plus version 4.5™). Results: Lidocaine had no pro- or antiangiogenic effects on CAM. The histological slides have shown collagen fibers as possible injury and/or reparation signals. The chick embryo under lidocaine effects has suffered malformation of ventral wall, malformation of jaw, as well as morphological changes of the fingers and wings. Conclusion: According to our experimental protocol, Lidocaine had no effects on the number of vessels on the CAM, but the histological analysis showed disturb on reparation process. The chick embryos under drug effects were modified at different body structures. The results reported in this study (potentially caused by the anesthetic agent) provide additional perspectives to better understand the mechanisms triggered by Lidocaine...