Análise da viabilidade e infectividade de taquizoítas de toxoplasma gondii em condições axênicas / Viability and infectivity analysis of toxoplasma gondii underaxenic conditions

Aims: To investigate the infectivity and viability of the tachyzoite form of Toxoplasma gondii maintained in axenic medium. Methods: Tachyzoites of Toxoplasma gondii isolated from infected mice were suspended in phosphate-buffered saline pH 7.2 or phosphate-buffered saline pH 7.2 plus 10% or 20% foetal calf serum, and incubated for 24 and for 48 hours at 37ºC. Afterwards the parasites were: (i) incubated with propidium iodide and analysed by flow cytometry, using the fluorescence-activated cell sorting (FACS) system; (ii) injected in mice to check the parasite viability in axenic conditions and, (iii) added to mouse embryonic fibroblasts to investigate their infectivity and ability to intracellular development. Results: Analysis by flow cytometry showed that Toxoplasma gondii tachyzoites maintained in phosphate-buffered saline supplemented with 20% foetal calf serum displayed high cellular viability. The parasites kept their infectivity in both the in vivo and the in vitro systems, respectively demonstrated by their ability to replicate in mice and to form rosettes in mouse embryonic fibroblasts. Conclusions: Our data open new perspectives for the study of different aspects of Toxoplasma gondii cell biology, including nutrition mechanisms, in vitro drug trials, or cellular and molecular studies to be performed directly on the parasite.

Objetivos: investigar a infectividade e a viabilidade de formas taquizoítas de Toxoplasma gondii mantidas em meio axênico. Métodos: taquizoítos de Toxoplasma gondii foram isolados de camundongos infectados, ressuspensos em tampão fosfato-salino pH 7,2 ou tampão fosfato-salino pH 7,2 mais soro fetal bovino a 10% ou 20% e incubados por 24 e 48 horas a 37ºC em atmosfera contendo 5% de CO2. A seguir os parasitos foram: (i) incubados com iodeto de propídio e analisados por citometria de fluxo utilizando a técnica de separação de células ativada por fluorescência (fluorescence activated cell sorting ? FACS); (ii) injetados em camundongos para analisar a infectividade dos parasitos mantidos em condições axênicas; e (iii) adicionados à cultura de fibroblastos de embrião de camundongo para investigar a sua capacidade infectiva e multiplicativa com formação de rosetas e lise celular. Resultados: a análise por citometria de fluxo mostrou que os taquizoítos de Toxoplasma gondii mantidos em tampão fosfato-salino suplementado com 20% de soro fetal bovino apresentaram elevada viabilidade celular. Os parasitos mantiveram sua infectividade nos sistemas in vivo e in vitro, respectivamente demonstrada por sua capacidade de se replicar em camundongos e de infectar culturas de fibroblastos. Conclusões: nossos dados abrem novas perspectivas para o estudo de diferentes aspectos da biologia do Toxoplasma gondii, incluindo mecanismos de nutrição, ensaios experimentais de drogas in vitro, ou estudos da biologia celular e molecular diretamente sobre o parasito.

Intravitreal bevacizumab in pigmented rabbit eyes: histological analysis 90 days after injection / Bevacizumabe intravítreo em olhos de coelhos não albinos: análise histológica 90 dias após a injeção

PURPOSE: To evaluate bevacizumab toxicity in neurosensorial retina and retinal pigment epithelium in pigmented rabbit eyes by means of histological studies. METHODS: Thirty eyes of fifteen rabbits were distributed into three groups: sham group (S), that received a 0.1 ml balanced saline solution (BSS) intravitreal injection (10 eyes); group 1, that received a 1.25 mg (0.1 ml) bevacizumab intravitreal injection (10 eyes); and group 2, that received a 2.5 mg (0.1 ml) bevacizumab intravitreal injection (10 eyes). Rabbits were sacrificed 90 days after the procedure and both eyes of each rabbit were enucleated. A histological examination of neurosensorial retina and retinal pigmented epithelium (RPE) was performed. Its morphological features and layer thickness were also analyzed. RESULTS: No histological differences in neurosensorial retina or in retinal pigmented epithelium were found and layer thickness did not differ significantly between balanced saline solution-injected eyes and bevacizumab-injected eyes. CONCLUSION: After a 90-day follow-up period, a single 1.25 or 2.5 mg bevacizumab intravitreal injection did not lead to toxic damage in the neurosensorial retina and retinal pigment epithelium of pigmented rabbit eyes, and it appears to be a safe procedure for retinal neovascular diseases.

OBJETIVOS: Avaliar a toxicidade do bevacizumabe na retina neurossensorial e epitélio pigmentado da retina (EPR) em olhos de coelhos não albinos pelos estudos histológicos. MÉTODOS: Trinta olhos de 15 coelhos foram distribuídos em três grupos: 10 olhos no grupo placebo (P), que recebeu uma injeção intravítrea de 0,1 ml de solução salina balanceada (SSB); 10 olhos no grupo 1, que recebeu uma injeção intravítrea de 1,25 mg (0,1 ml) de bevacizumabe; e 10 olhos no grupo 2, que recebeu uma injeção intravítrea de 2,5 mg (0,1 ml) de bevacizumabe. Os coelhos tiveram seus dois olhos enucleados sob anestesia geral e submetidos à eutanásia 90 dias após a injeção. Foi realizada avaliação histológica na retina neurossensorial e no epitélio pigmentado da retina e seus aspectos morfológicos e espessuras das camadas retinianas foram analisadas. RESULTADOS: Não foi observada diferença significante entre a morfologia histológica e espessura das camadas retinianas entre o grupo P (SSB) e os grupos 1 e 2 (bevacizumabe 1,25 mg e 2,5 mg, respectivamente). CONCLUSÃO: Após um seguimento de 90 dias, uma única injeção intravítrea de bevacizumabe com 1,25 e 2,5 mg não levou a danos histológicos na retina neurossensorial e epitélio pigmentado da retina em olhos de coelhos não albinos e parece ser um procedimento seguro para o tratamento das doenças neovasculares da retina.

Alterações morfológicas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii (Apicomplexa, Sarcocystidae) / Morphological alterations of the retina of mice C57BL/6 infected with Toxoplasma gondii (Apicomplexa, Sarcocystidae)

Toxoplasmose, cujo agente etiológico é o Toxoplasma gondii acontece em cerca de 10 a 30 por cento de indivíduos em todo o mundo. No Brasil, a prevalência sorológica para o T. gondii varia entre 50 e 80 por cento da população saudável. A infecção pelo T. gondii em humanos é muito comum, contudo, a doença clínica está restrita a indivíduos imunocomprometidos e à transmissão congênita... O principal objetivo deste trabalho é documentar as alterações morfológicas e o comprometimento da retina na infecção pelo T. gondii no modelo murino, utilizando camundongos C57BL/6, infectados pelas vias congênita, intravitreal e intraperitoneal. Camundongos C57BL/6 fêmeas adultas foram divididos em três grupos experimentais: grupo 1: embriões oriundos de fêmeas grávidas inoculadas via oral (gavagem) com 5 cistos de T. gondii no 10º dia de gestação; grupo 2: fêmeas adultas inoculadas via intravitreal (i.v.) com 5x103 bradizoítas, oriundos de cistos rompidos; e grupo 3: fêmeas adultas inoculadas via intraperitoneal (i.p.) com 50 cistos de T. gondii. Os olhos foram enucleados durante o curso da infecção e avaliados utilizando as microscopias de luz e eletrônica de transmissão. A dosagem de anticorpos IgM e IgG revelou o curso da doença, caracterizando as fases aguda e crônica. A análise histopatológica dos olhos dos embriões não revelou a presença do parasita... Nos grupos 2 e 3 foram observados parasitas no interior dos vasos, acompanhados de infiltrado inflamatório, edema, migração do epitélio pigmentado da retina (EPR) e formação de lacunas nos segmentos externos dos fotorreceptores (FTR). Os cistos foram evidenciados 60 dias pós-infecção, na camada nuclear interna da retina. A análise ultra-estrutural mostrou detalhes dos cistos e das células da retina, e alterações oriundas dos infiltrados inflamatórios e da migração celular nas camadas externas e internas da retina. Concluímos que as lesões observadas foram focais e restritas à retina. Os segmentos externos dos FTR foram as estruturas mais alteradas da retina, provavelmente devido a migração das células inflamatórias e do EPR, alterando assim, sua arquitetura. A presença do parasita nos vasos dos tecidos oculares, nos animais inoculados via i.v. e i.p., em todos os períodos examinados, indica a existência de parasitas circulantes, mesmo na fase crônica da doença, sugerindo que sejam oriundos do rompimento de cistos.