Chromatographic analysis, antiproliferative effect and genotoxicity of aqueous extracts of Citrus sinensis (L) osbeck on the Allium cepa L test system / Análise cromatográfica, efeito antiproliferativo e genotoxicidade de extratos aquosos de Citrus sinensis (L) osbeck sobre o sistema teste de Allium cepa L

The species Citrus sinensis (L.) Osbeck (orange) is used in folk medicine as an infusion (tea) for the treatment of nerve irritation, insomnia, spasms, whooping cough, flue, and gastrointestinal problems. The aim of this study was to evaluate the antiproliferative and genotoxic potential of aqueous extracts of C. sinensis testing by Allium cepa L., as well as to determine the components in the complex mixture (tea). Leaves from two populations of this species were used in the preparation of infusions at two concentrations: 6g.L-1 and 24g.L-1, besides using distilled water as a negative control and 9.6% glyphosate as a positive control. Six groups of four bulbs of A. cepa were used, each group corresponding to one of the treatments. The bulbs were rooted in distilled water and then transferred to the respective treatments where they remained for 24 hours (the bulbs of the negative control remained in distilled water). The rootlets were collected, fixated in ethanol-acetic acid (3:1) for 24 hours and stored in 70% alcohol. 4,000 cells were analyzed per group of bulbs, and the calculated mitotic indices were submitted to statistical analysis using the c 2 test. The aqueous extracts of C. sinensis have as main components flavonoids and phenolic acids. The values of the mitotic index decreased with increasing concentration of the extracts relative to the control in water. The results indicated that the orange aqueous extracts in the studied concentrations in both populations have antiproliferative and genotoxic effects on the cell cycle of A. cepa.

A espécie Citrus sinensis (laranjeira) (L.) Osbeck é usada na medicina popular como infusão (chá) para o tratamento de irritações nervosas, insônia, espasmos, tosse convulsa, gripes e problemas gastrointestinais. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial antiproliferativo e genotóxico dos extratos aquosos de Citrus sinensis pelo teste de Allium cepa L., bem como determinar os componentes na mistura complexa (chá). Folhas de duas populações dessa espécie foram utilizadas no preparo das infusões em duas concentrações: 6g.L-1 e 24g.L-1, além de serem usados água destilada como controle negativo e glifosato 9,6% como controle positivo. Utilizaram-se seis grupos de quatro bulbos de A. cepa, cada grupo correspondendo a um dos tratamentos. Os bulbos foram enraizados em água destilada e então transferidos para os respectivos tratamentos onde permaneceram por 24 horas (os bulbos do controle negativo permaneceram em água destilada). As radículas foram coletadas, fixadas em etanol-ácido acético (3:1) por 24 horas e armazenadas em álcool 70%. Foram analisadas 4,000 células por grupo de bulbos, e os índices mitóticos calculados submetidos à análise estatística pelo teste c 2. Os extratos aquosos de C. sinensis têm como componentes principais flavonoides e ácidos fenólicos. Os valores dos índices mitóticos diminuíram com o aumento das concentrações dos extratos, em relação ao controle em água. Os resultados indicaram que os extratos aquosos de laranjeira nas concentrações estudadas das duas populações possuem ação antiproliferativa e genotóxica sobre o ciclo celular de A. cepa.

Efeito de metabólitos produzidos por Trichoderma spp. sobre o índice mitótico em células das pontas de raízes de Allium cepa / Effect of metabolites produced by Trichoderma spp. on mitotic index in cells of Allium cepa root tips

Microrganismos do solo produzem metabólitos importantes para a produção de compostos biologicamente ativos. Dentre estes microrganismos, as espécies de trichoderma (Trichoderma spp.) possuem a capacidade de produzir metabólitos. A promoção do desenvolvimento de plantas por trichoderma pode estar relacionada, entre outros fatores, ao estimulo à multiplicação celular, através da produção de hormônios, entre outros. O método de avaliação do índice mitótico em raízes de Allium cepa é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, OMS) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP) como um eficiente teste para análise e monitoramento in situ. O objetivo do estudo foi selecionar cepas e produtos biológicos comerciais de trichoderma, utilizados no controle biológico de fitopatógenos que promovam o aumento do índice mitótico em células de pontas de raízes pelo sistema teste de A. cepa. Foram utilizadas cepas de Trichoderma harzianum (2B2, 2B22, 2B12); Trichoderma viride (TSM1, TSM2, C1) e os produtos biológicos comerciais de trichoderma, Agrotrich® e Trichodermil®. Os bulbos de Allium cepa foram arranjados em dez tratamentos (quatro repetições por tratamento), oito com metabólitos de cepas de Trichoderma spp. e dois controles na ausência de metabólitos. A contagem das células ocorreu na região meristemática, onde foram contadas 500 células por bulbo em cada uma das lâminas. Foram observadas as células em interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase, com auxílio de microscópio ótico com a objetiva de 40X. Foram contadas as células de cada uma das fases do ciclo celular estudadas, após calculou-se os índices mitóticos. A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste c 2 (Qui-quadrado), com probabilidade de 5%, pelo programa estatístico BioEstat 4.0. Os tratamentos T1, T3 e T4 (metabólitos das cepas 2B2, 2B12 e C1 de trichoderma, respectivamente) apresentaram os maiores números de células para as fases prófase, metáfase, anáfase e telófase e alcançaram os maiores IM (c 2= 5.45 a= 0.05), (c 2= 5.0 a= 0.05) e (c 2= 3.92 a= 0.05), respectivamente. O tratamento controle T10 (meio líquido BD), apresentou o maior número de células em interfase, e o menor nas fases da divisão celular. O teste com raízes de Allium cepa possibilita selecionar cepas de trichoderma que induzem o aumento do índice mitótico em pontas de raízes pela ação de metabólitos e apresenta variabilidade entre as cepas estudadas.

Soil microorganisms produce metabolites important for the production of biologically active compounds. In relation to these organisms, species of trichoderma (Trichoderma spp.) have the ability to produce metabolites. Promoting the development of plants by trichoderma may be related, among other factors, to stimulate cell proliferation through the production of hormones, among others. The method of evaluation of mitotic index in Allium cepa roots is validated by the International Programme on Chemical Safety (IPCS, WHO) and United Nations Environment Programme (UNEP) as an effective test for in situ analysis and monitoring. The aim of the study was to select strains and commercial biological products trichoderma used in biological control of plant pathogens that promote increased mitotic index in cells of the root tips of A. cepa test system. Strains of Trichoderma harzianum (2B2, 2B22, 2B12) and Trichoderma viride (TSM1, TSM2, C1) and the biological products commercials Agrotrich® and Trichodermil® of trichoderma were used. The bulbs of Allium cepa were arranged in ten treatment (four replicates per treatment), eight with metabolite of Trichoderma spp. and two controls in the absence of metabolites. Cell counts occurred on the meristematic region where 500 cells were counted for each bulb on the blades. Cells were observed in interphase, prophase, metaphase, anaphase and telophase, with the aid of an optical microscope with a 40X objective. The cells were counted in each phase of the cell cycle analyzed and after it was calculated mitotic rates. Statistical analysis of data was performed by c 2 test (chi-square), with a probability of 5%, the statistical program BioEstat 4.0. Treatments T1, T3 and T4 (metabolites of isolates 2B2, 2B12 and C1 of trichoderma, respectively) showed higher cell numbers for the phases prophase, metaphase, anaphase and telophase and reached the highest IM (c 2= 5.45 a= 0.05), (c 2= 5.0 a= 0.05) e (c 2= 3.92 a= 0.05, respectively. The T10 control (liquid medium BD), had the highest number of interphase cells, and the lower phases of cell division. The test with Allium cepa roots enables selecting trichoderma isolates that induce increased mitotic index in root tips by the action of metabolites and shows variability among the isolates studied.

Chromatographic analysis and antiproliferative potential of aqueous extracts of Punica granatum fruit peels using the Allium cepa test

Punica granatum L., locally known as romanzeira, is native to Asia but found throughout Brazil. P. granatum is used for treating inflammatory, infectious and respiratory diseases. The aim of this study was to evaluate the chromatography and genotoxicity of an aqueous extract of P. granatum (pomegranate) fruit peel using the Allium cepa L. test. The experiment set-up entailed 7 treatments: T1-distilled water, T2-tea 5 g.L-1, T3-tea 10 g.L-1, T4-glyphosate at 9.6%, T5-glyphosate with subsequent recovery in distilled water, T6-glyphosate with subsequent recovery in tea 5 g.L-1 and T7-glyphosate with subsequent recovery in tea 10 g.L-1. The rootlets were collected and fixed in ethanol:acetic acid (3:1) for 24 hours, then stored in 70% ethanol under refrigeration. Analysis was performed using high performance liquid chromatography for the quantification of the extracted phenolic compounds. Gallic acid, catechin, caffeic acid, and rutin were abundant in the extracts of P. granatum. The extracts were found to exhibit antiproliferative potential but not antimutagenic or genotoxic activity.

Punica granatum L., conhecida como romanzeira, é originária da Ásia e encontra-se distribuída por todo Brasil. É usada para o tratamento de doenças inflamatórias, infecciosas e respiratórias. Em decorrência da grande utilização de recursos fitoterápicos, é necessário esclarecer à população sobre a grande quantidade de substâncias existentes nas plantas e sobre os benefícios e prejuízos de tais substâncias à saúde. O presente trabalho objetivou realizar a análise cromatográfica e o estudo da genotoxicidade dos extratos aquosos das cascas dos frutos de P. granatum através do teste de Allium cepa L. Para a montagem do experimento, foram utilizados 7 tratamentos: T1-água destilada, T2-chá 5 g.L-1, T3-chá 10 g.L-1, T4-glifosato a 9,6%, T5-glifosato para recuperação em água destilada, T6-glifosato para recuperação em chá 5 g.L-1 e T7-glifosato para recuperação em chá 10 g.L-1. As radículas foram coletadas e fixadas em etanol:ácido acético (3:1) por 24 horas, e armazenadas em álcool 70%, sob refrigeração. Realizou-se análise por cromatografia líquida de alta eficiência para quantificação dos compostos fenólicos. Nos extratos de P. granatum foram observados em maior quantidade: ácido gálico, catequina, ácido cafeico e rutina. Além disso, os extratos demonstraram potencial antiproliferativo, sem apresentar atividade antimutagênica e genotóxica.

Genotoxic and chromatographic analyses of aqueous extracts of Peltodon longipes Kunth ex Benth. (hortelã-do-campo)

Peltodon longipes is used as a stimulant and emmenagogue. The objective of this study was to perform genotoxic and chromatographic analyses of the extracts of two samples of P. longipes, collected from the cities of Santa Maria and Tupanciretã, RS, Brazil. The Allium cepa assay was used to analyze genotoxicity while high-performance liquid chromatography was employed to determine phenolic compounds. The genotoxicity experiment consisted of nine groups each comprising four A. cepa bulbs. Bulb roots were developed in distilled water and then transferred for the treatments, for 24 hours, and the negative control remained in water. The treatments were: aqueous extracts at concentrations of 5 and 15 g L-1 for each sample, plus four groups treated with 1% glyphosate, one of which was used as a positive control and the other three for testing DNA damage recovery using water and the extracts of P. longipes from Santa Maria. All extracts of P. longipes exhibited anti-proliferative potential, although the effect was significantly greater for the extracts from the Tupanciretã sample. This sample also contained the highest amount of rosmarinic acid and kaempferol, which may confer the effects found in these extracts. Only extracts from the Santa Maria sample exhibited genotoxic potential.

Peltodon longipes é utilizada como estimulante e emenagoga. Objetivou-se realizar análises genotóxica e cromatográfica dos extratos de duas amostras de P. longipes, coletadas nos municípios de Santa Maria e Tupanciretã, RS, Brasil. O teste de Allium cepa foi utilizado para análise da genotoxicidade e a cromatografia líquida de alta eficiência, para determinação dos compostos fenólicos. O experimento de genotoxicidade constou de nove grupos de quatro bulbos de A. cepa. Os bulbos foram enraizados em água destilada e após transferidos para os tratamentos, por 24 horas, permanecendo o controle negativo em água. Os tratamentos foram: extratos aquosos nas concentrações de 5 e 15 g L-1 de cada amostra, além de quatro grupos tratados com glifosato 1%, um deles usado como controle positivo e outros três para testar a recuperação de danos ao DNA, utilizando água e os extratos de P. longipes da amostra de Santa Maria. Todos os extratos de P. longipes demonstraram potencial antiproliferativo, porém o efeito foi significativamente maior para os extratos da amostra de Tupanciretã. Essa amostra também apresentou maior quantidade de ácido rosmarínico e canferol, o que pode estar relacionado com os efeitos encontrados nesses extratos. Somente extratos da amostra de Santa Maria demonstraram potencial genotóxico.

Antiproliferative and genotoxic effects of Mikania glomerata (Asteraceae)

Mikania glomerata is a plant used in Brazilian traditional medicine, known as 'guaco'. It possesses anti-inflammatory properties and the aqueous extracts of its leaves are indicated for the treatment of diseases of the respiratory tract. This study aimed at evaluating the antiproliferative and genotoxic effect of Mikania glomerata leaf infusions on the cell cycle of onion. The material used was collected in the native environment from Rio Grande do Sul State, Brazil. Aqueous extracts through infusions were prepared in two concentrations: 4g/L (usual concentration) and 16g/L (4x more concentrated) of each of the populations. Two groups of four onion bulbs for each plant population were used plus a control group. The rootlets were fixed in ethanol-acetic acid (3:1), conserved in ethanol 70% and slides were prepared using the squashing technique colored with orcein 2%. The cells were observed and analyzed during cell cycle. Per group of bulbs, 2000 cells were analyzed, and the mean values of the cell number of each of the phases of the cell cycle were calculated, determining the mitotic index (MI). Statistic analyses of the data were carried out by the x2 ( p= 0.05) test. We conclude that M. glomerata presents both antiproliferative and genotoxic activity.

Cytotoxic effects of infusions (tea) of Solidago microglossa DC. (Asteraceae) on the cell cycle of Allium cepa / Efeitos citotóxicos das infusões (chá) de Solidago microglossa DC. (Asteraceae) no ciclo celular de Allium cepa

The medicinal specie Solidago microglossa DC., which is native from South America, is used as infusion (tea) for stomach disorders in popular medicine. This study aimed to evaluate the potential cytotoxic effect of these infusions on the cell cycle of Allium cepa. In natura leaves of three populations of this species were used in preparing infusions at two concentrations: 1.75 mg/mL and 14 mg/mL. Onion (Allium cepa) root-tip cells were used as test system in in vivo assays. Slides were done through smashing technique. Cells were analyzed in all cell cycles of A. cepa, totalizing 6000 cells for each group of bulbs. The mitotic index (MI) was calculated, and the statistical analysis was carried out through the Chi-square test (χ2 = 0.05). The results show that the infusions of S. microglossa at a highest concentration (14 mg/mL) caused a significant reduction in the MI compared with control in the studied populations. In concentrations commonly used by people there was a significant increase of MI in relation to controlled populations 1 and 3 and a decrease in population 2. In conclusion, infusions of S. microglossa presented antiproliferative effect at a highest concentration.

A espécie medicinal Solidago micrglossa DC., a qual é nativa da América do Sul, é usada como infusão (chá) para desordens estomacais na medicina popular. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial efeito citotóxico dessas infusões no ciclo celular de Allium cepa. Folhas in natura de três populações dessa espécie foram utilizadas no preparo das infusões em duas concentrações: 1,75 mg/mL e 14 mg/mL. Células de raízes de cebola (Allium cepa) foram usadas como sistema teste nos ensaios in vivo. As lâminas foram feitas através da técnica de esmagamento. As células foram analisadas em todos os ciclos celulares de A. cepa, totalizando 6000 células para cada grupo de bulbos. O índice mitótico (IM) foi calculado e a análise estatística foi realizada através do teste Qui-quadrado (χ2 = 0,05). Os resultados mostraram que as infusões de S. microglossa na maior concentração (14 mg/mL) causou uma redução no IM comparado com os controles nas populações estudadas. Nas concentrações comumente usadas pelas pessoas houve um aumento significativo do IM em relação ao controle nas populações 1 e 3 e foi reduzido na população 2. Em conclusão, infusões de S. microglossa apresentam efeito antiproliferativo na maior concentração testada.

Meiotic analysis of the germoplasm of three medicinal species from Asteraceae family / Análise meiótica do germoplasma de três espécies medicinais da família Asteraceae

Cytogenetic characterization was carried out on 12 accessions from Aster squamatus (Spreng.) Hieron., Pterocaulon polystachyum DC, and Solidago microglossa DC by studying their meiotic behavior and pollen viability. These species are from the Asteraceae family, native to Rio Grande do Sul State, Brazil, and are important for medicinal use. Young inflorescences with four accessions of each species were collected, fixed in ethanol-acetic acid (3:1), and conserved in ethanol 70 percent until use. The method used was that of squashing the anthers and coloring with acetic orcein 2 percent. Meiosis was regular in all accessions, presenting chromosomal associations preferentially bivalent, where n=10 was found for Aster squamatus and n=9 for Pterocaulon polystachyum, and Solidago microglossa. The studied accessions presented a Meiotic Index (MI) that varied from 65 percent to 87 percent in Aster squamatus, 85 percent to 92 percent in Pterocaulon polystachyum, and 64 percent to 92 percent in Solidago microglossa, indicating meiotic stability, although irregularities appeared during the cellular division. The pollen viability estimative was high in all studied accessions. These results indicate that the studied species can be included in future studies of genetic breeding.

Foi realizada a caracterização citogenética de doze acessos de Aster squamatus, Pterocaulon polystachyum e Solidago microglossa, espécies da família Asteraceae, nativas do Rio Grande do Sul, Brasil, por meio do estudo do comportamento meiótico e da viabilidade polínica, que possuem grande importância para uso medicinal. Inflorescências jovens de quatro acessos de cada espécie foram fixadas em álcool-ácido acético (3:1) e conservadas em álcool 70 por cento até o uso. O método utilizado foi o de esmagamento de anteras e a coloração com orceína acética 2 por cento. A meiose foi regular em todos os acessos, apresentando associações cromossômicas preferencialmente em bivalentes, encontrando-se n=10 para Aster squamatus e n=9 para Pterocaulon polystachyum e Solidago microglossa. Os acessos apresentaram índice meiótico que variou de 65 por cento a 87 por cento em Aster squamatus, de 85 por cento a 92 por cento em Pterocaulon polystachyum e de 64 por cento a 92 por cento para Solidago microglossa, indicando estabilidade meiótica, apesar de o aparecimento de irregularidades durante a divisão celular. A estimativa da viabilidade polínica foi alta para todos os acessos estudados. Esses resultados indicam que as espécies estudadas podem ser incluídas em futuros trabalhos de melhoramento genético.

Uso do sistema teste de Allium cepa como bioindicador de genotoxicidade de infusões de plantas medicinais / The use of Allium cepa test as a bioindicator of genotoxicity of medicinal plants infusions

Mundialmente, muitas espécies de plantas medicinais são utilizadas para o tratamento de doenças. No entanto, a maioria dessas espécies não foram suficientemente estudadas, principalmente quanto à presença de substâncias citotóxicas/mutagênicas em sua composição ou decorrentes do próprio metabolismo e podem causar danos à saúde da população. A presença de substâncias mutagênicas nas espécies vegetais que causam alterações cromossômicas podem ser detectadas durante o ciclo celular de uma espécie. O sistema teste de Allium cepa é freqüentemente utilizado para avaliação do potencial genotóxico de extratos de plantas medicinais através da análise de células meristemáticas provenientes de pontas de raízes tratadas com infusões medicinais (chás). O conhecimento do potencial genotóxico destas espécies medicinais, através da análise do ciclo celular de Allium cepa serve como indicativo de segurança para a população que utiliza chás medicinais como única alternativa para o tratamento de doenças. Essa revisão, objetiva informar a respeito da importância do teste de Allium cepa para avaliação preliminar da genotoxicidade de infusões de plantas medicinais.

All over the world, many species of medicinal plants are used for disease treatments. However, most of them were not deeply studied; and the presence of cytotoxic or mutagenic substances in their composition or resulting from their metabolism may be harmful to human beings. The mutagenic effects caused by such substances result in chromosomal changes which are detecTable during the cell cycle of a species through cytogenetic analysis. The Allium cepa test system is widely used for evaluating the genotoxic potential of infusions (tea) made of medicinal plants, through the cell cycle analysis. The knowledge of the genotoxic potential of such species through the Allium cepa test serves as a warning and safety bioindicator for the population who uses medicinal tea quite often as the unique alternative for disease treatment of its people. In the review article, we intend to inform people about the importance of the Allium cepa test for evaluating the genotoxicity of infusions of medicinal plants.

Número de cromossomos em populações de Achyrocline satureioides Lam. (marcela) do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil / Chromosome number in Achyrocline satureioides Lam. populations from Rio Grande do Sul State, Brazil

A caracterização citogenética das plantas medicinais de um país amplia as perspectivas da conservação da diversidade vegetal de espécies comumente utilizadas na medicina popular. Das espécies utilizadas medicinalmente no Brasil, algumas são nativas, dentre as quais se destaca, Achyrocline satureioides Lam. (marcela) da Família Asteraceae. Neste estudo, pela primeira vez, foi realizada a contagem do número cromossômico de populações de marcela, nativas do estado do Rio Grande do Sul. Foram coletadas sementes de cinco populações de marcela em seus locais de origem, as quais foram colocadas para germinar em ambiente controlado. Após a germinação, as pontas de raízes foram coletadas e pré-tratadas com paradiclorobenzeno durante cinco horas, fixadas em álcool absoluto:ácido acético glacial (3:1) por 24h a temperatura ambiente e, posteriormente, conservadas em álcool 70 por cento, até o seu uso. A análise do número cromossômico foi feita a partir da confecção de lâminas das pontas das raízes, sendo que para o preparo das lâminas utilizou-se a técnica do esmagamento, hidrólise em HCl 5N por 10min, aplicação de ácido acético 45 por cento durante 1min, esmagamento das pontas das raízes e coloração com orceína acética a 2 por cento. Todas as populações estudadas apresentaram 2n=24 cromossomos, o que sugere ser esse o número diplóide da espécie.

Effects of Pterocaulon polystachyum DC. (Asteraceae) on onion (Allium cepa) root-tip cells

In Brazil leaf infusions of the plant Pterocaulon polystachyum DC (Asteraceae) are used to treat digestive problems. We used plants from six P. polystachyum populations to prepare fresh aqueous leaf infusions at the concentration normally used in Brazil (2.5 g L-1) and at twice (5 g L-1) and four times (10 g L-1) this concentration. We rooted onion bulbs in a water control or one of the infusions for 24 h and used the in vivo onion (Allium cepa) root-tip cell test to investigate the potential mutagenicity of the infusions by calculating the mitotic index for the control and the experimental treatments and comparing them using the Chi-squared test (chi2, p = 0.05). There was a highly significant decrease in the mitotic index of root-tip cells treated with infusion as compared to those exposed to water only. These results indicate that P. polystachyum infusions present cytotoxic and anti-proliferative activity and therefore have therapeutic potential.

Análise bromatológica comparativa entre acessos diplóides, tetraplóides africanos e tetraplóides brasileiros de Hemarthria altissima (Poiret) Stapf & Hubbard / Bromatologic analysis comparative between access African diploid, tetraploid and Brazilian tetraploid of Hemarthiria altissima (Poiret) Stapf & Hubbard

Foi comparada a qualidade da forragem entre os acessos diplóides e tetraplóides africanos e tetraplóides brasileiros de Hemarthria altissima. O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Universidade Federal de Santa Maria. Os resultados obtidos mostraram Digestibilidade in vitro da matéria orgânica satisfatória para os acessos tetraplóides africanos e brasileiros, sendo que os brasileiros tiveram teores de proteína bruta signifi-cativamente maiores que os africanos. O tetraplóide natural do Rio Grande do Sul apresentou maior nível de proteína bruta.

This study evaluated the quality among african dipoloid, tetraploid and brazilian tetraploid accessions Hemarthria altissima, the Experiment was conducted in greenhouse at the Federal University of Santa Maria. Results suggested that in vitro organic matter digestibility was satisfactory for tetraploid brazilian and african accessions, crude protein volues obtained for brazilian accessions were significantly higher than the african accessions. The tetraploids from Rio Grande do Sul region presented higher crude protein level.