ABSTRACT
La proquimosina de ternero fusionada al gen de la superóxido dismutasa humana (SOD) fue sintetizada en forma insoluble en Saccharomyces cerevisiae. Las condiciones que permiten la solubilización de la proteína fueron investigada, siendo la desnaturalización el proceso esencial mediante el cual es solubilizado más del 90 % del producto recombinante. Se estudiaron diferentes parámetros que intervienen en el proceso de renaturalización de la SOD proquimosina, describiéndose un procesamiento mediante el cual es posible recuperar el 25 % de la proquimosina soluble en su forma nativa. Más del 98 % de la proteína fue activada, obteniéndose un preparado enzimático cuya función biológica fue determinada mediante el proceso de coagulaciónm de la leche
Subject(s)
Cattle , Chymosin , Saccharomyces cerevisiae , Superoxide Dismutase , CubaABSTRACT
Se reporta el desarrollo de un micrométodo para la determinación de la actividad de la alcohol oxidasa en levaduras metilotróficas, basado en la gran cantidad de enzima que se acumula en estos microorganismos al crecerlos en presencia de metanol. El método es una modificación del anteriormente reportado por Ellis et al. (1985). La proporción de alcohol oxidasa en extractos celulares de Pichia pastoris y Hansenula polimorpha resultó ser muy alta: 32 % y 34 % de la proteina total respectivamente. La inducción de la enzima ocurre como parte de una respuesta fidiológica general al metanol, que incluye la inducción de otras proteinas y un aumento en el número y tamaño de los peroxisomas. Para obtener una alta actividad de alcohol oxidasa es necesario considerar tres parámetros sencillos: el tiempo de crecimiento en condiciones de represión, la densidad óptica en el momento de la inducción y la duración de la inducción
Subject(s)
Methanol , Yeasts , CubaABSTRACT
Se examinó el efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la proteina fusionada SOD-proquimosina sintetizada en Sacharomyces cerevisiae bajo el control del fragmento corto del promotor que regula la síntesis de la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. El proceso fermentativo de 5 y 50 l de cultivo, obteniéndose resultados similares en ambas escalas. Cuando las células son cultivadas en medio selectivo suplementado con sacarosa al 5 % e hidrolizado de caseina al 2 % utilizando un sistema batch, la concentración relativa de SOD-proquimosina es incrementada 1,7 veces, mientras que la utilización del cultivo incrementado aumenta aproximadamente 4 veces la masa celular y eleva significativamente la producción de la proteina recombinante a un nivel del 2 % del total de la proteina celular
Subject(s)
Chymosin , Culture Media , Saccharomyces cerevisiaeABSTRACT
Kleyveromyces lactis es una levadura industrial cuyo uso como hospedero para la expresión de genes cobra interés creciente. El método de transformación desarrollado en el presente trabajo rinde 5x10*transformantes por microgramo de ADN replicativo y de 5 a 10 colonias x 10*g de ADN integrativo. Sólo el 16% de las colonias transformantes pierde la información que porta el lucus de integración, el resto permanece con fenotipo lac+. El gen de la renina del hongo Mucor pusillus fuevexpresado en Kluyveromyces lactis bajo el control del promotor LAC4 y la señal de secreción del factor * de Saccharomyces cerevisiae. La enzima fue secretada eficientemente al medio de cultivo y los niveles de secreción fueron dependientes de la adición de lactosa durante el crecimiento y del Ph de crecimiento
Subject(s)
Fungi/genetics , Gene Expression , Kluyveromyces , Renin/metabolismABSTRACT
Los genes codificantes para los interferones alfa-2 y gamma humanos fueron clonados y expresados eficientemente bajo el control del promotor triptófano de E. coli. La adición de una señal de terminación de la transcripción en ambos ARNn dió como resultado un aumento de la expresión de las respectivas proteinas
Subject(s)
Escherichia coli/genetics , Gene Expression , Interferon Type I , Transcription, GeneticABSTRACT
El gen de la proquimosina de ternero (PQ) fue fusionado a la secuencia que codifica los primeros 41 aminoácidos de la superóxido dismutasa humana (SODh). Esta fusión se expresó en la levadura S. cerevisiae bajo el control del fragmento corto del promotor que regula la síntesis de la enzima gliceroaldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GFD) en este microorganismo. Los niveles de expresión de la proteina fusionada están en el orden del 2 % con respecto a la proteína total, produciéndose en forma insoluble y asociada a la membrana. El producto obtenido después de su activación presentó las mismas propiedades bioloógicas que la enzima natural
Subject(s)
Genes , Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenases , Renin , Saccharomyces cerevisiae , Superoxide DismutaseABSTRACT
En este trabajo se describe la clonación y la expresión en E. coli del gen de la quimosina, enzima de importancia industrial para la producción de quesos. Los clones se identificaron analizando una genoteca de ADN complementario al ARN poli (A) proveniente del estómago de ternero, utilizando como sonda dos oligonucléotidos sintéticos. La región del gen, codificante a la proquimosina, fue expresada bajo el control del promotor triptófano. Se alcanzó una expresión equivalente al 10 % de la proteína total. La proteína fue detectada insoluble y formando cuerpos de inclusión. La enzima producida demostró tener propiedades semejantes a la natural.