Production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and standardization of direct immunofluorescence for detecting oocysts in water / Produção de anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium e padronização da imunofluorescência direta para a detecção de oocistos na água

INTRODUCTION: The production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and its use in direct immunofluorescence assays to determine the presence of Cryptosporidium in water are described in the present work. METHODS: Two rabbits were immunized with soluble and particulate antigens from purified Cryptosporidium oocysts. The sera produced were prepared for immunoglobulin G extraction, which were then purified and conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC). Slides containing known amounts of oocysts were prepared to determine the sensitivity of the technique. To test the specificity, slides containing Giardia duodenalis cysts were prepared. RESULTS: The conjugate was successfully used in water samples experimentally contaminated with Cryptosporidium oocysts, and it was possible to detect up to five oocysts/spot, corresponding to contamination of 250 oocysts/mL. CONCLUSIONS: The three immunizations performed in the rabbits were enough to produce antibodies against Cryptosporidium, the standard direct immunofluorescence assay permitted the detection of five oocysts in 20 percent of the samples, and no cross-reaction with Giardia duodenalis cysts occurred.

INTRODUÇÃO: A produção de anticorpos policlonais anti-Cryptosporidium e sua utilização na imunofluorescência para determinar a presença de Cryptosporidium em água são descritas no presente trabalho. MÉTODOS: Dois coelhos foram imunizados com antígeno solúvel e particulado provenientes de oocistos purificados de Cryptosporidium. O soro produzido foi preparado para a extração de imunoglobulinas G, que foram purificadas e conjugadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Lâminas contendo quantidades conhecidas de oocistos foram preparadas para determinar a sensibilidade da técnica. Para testar a especificidade foram preparadas lâminas contendo cistos de Giardia duodenalis. RESULTADOS: O conjugado foi usado com sucesso em amostras de água contaminadas experimentalmente com oocistos de Cryptosporidium, sendo capaz de detectar até cinco oocistos/spots que corresponde a uma contaminação de 250 oocistos/mL. CONCLUSÕES: As três imunizações realizadas nos coelhos foram suficientes para produção de anticorpos contra Cryptosporidium; a reação de imunofluorescência direta padronizada permitiu a detecção de cinco oocistos em 20 por cento das amostras; não houve reação cruzada com cistos de Giardia duodenalis.

Production and characterization of monoclonal antibodies anti fragment Fc of bovine IgG

The aim of this work was to produce and characterize monoclonal antibodies anti bovine immunoglobulin G (IgG). Out of seven hybridomas, two were chosen based on the ELISA'S absorbance values and were labeled B4F11 and B3H12. These monoclonals were analyzed through Western Blot for IgG fragments obtained by proteolysis with papain, separated by electrophoresis in polyacrylamide gel electrophoresis with â-mercaptoetanol as reducing agent. This revealed that, possibly, the B4F11 was directed to a conformational antigen, and that B3H12 reacted in a specific fashion with Fc (Bovine IgG crystallizable fragment). This antibody could be used in the development of reagents to immunoassays relevant for research and diagnosis.

No Brasil, anticorpos anti-espécie específica usados em métodos de diagnóstico geralmente são importados, aumentando o custo das análises. Visando produzir insumos para métodos diagnóstico por enzimaimunoensaio, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar anticorpos monoclonais anti imunoglobulina G (IgG) bovina. De sete hibridomas obtidos e que apresentaram valores relevantes de absorbância em teste imunoenzimático (ELISA indireta), dois clones com melhor performance foram selecionados e designados B4F11 e B3H12. Estes anticorpos monoclonais foram analisados em Western Blot para reatividade com fragmentos de IgG bovina, obtidos por proteólise com papaína e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, com presença do agente redutor beta-mercaptoetanol. A eletroforese mostrou que o anticorpo B4F11, foi direcionado para um antígeno conformacional, e que o monoclonal B3H12 reagiu especificamente com a porção Fc da IgG bovina (fragmento cristalizável). Este anticorpo será utilizado no desenvolvimento de reagentes para imunoensaios de interesse à pesquisa e diagnósticos.