Integration, Viral Charge and E2 mRNA Levels in the Progresion of Intraepitelial Cervical Lesions / Integración, carga viral y niveles de arn mensajero de e2 de vph 16 en la progresión de lesiones intraepiteliales cervicales

RESUMEN Entre las lesiones intraepiteliales escamosas cervicales (LIE) es importante distinguir aquellas asociadas con mayor riesgo de cáncer de cuello uterino. El objetivo de este trabajo fue evaluar si los niveles de expresión de E2 del VPH16 en mujeres con LIE y con evidencia de integración viral se asocian con el grado de la lesión. Se analizaron 109 cepillados cervicales positivos para VPH 16 provenientes de 19 mujeres sin LIE, 45 mujeres con LIE de bajo grado (LIEBG) y 45 mujeres con LIE de alto grado (LIEAG). Se cuantificó el número de copias de ARNm de E2 y de los genes E2 y E6 mediante PCR en tiempo real para determinar la carga viral (E6) y la proporción E2/E6 para evaluar la integración viral. Se encontraron frecuencias similares de expresión de E2 en LEIBG y LEIAG 15/45 (33 %), la frecuencia en mujeres sin lesión fue menor 3/19 (15,8 %), todos los casos en los que se observó expresión del gen E2 tenían mezcla de ADN viral episomal e integrado. La carga viral aumentó significativamente a mayor grado de la lesión (ρ =0,049), mientras que la proporción E2/E6 disminuyó (ρ=0,049). El análisis ROC mostró una baja capacidad de los tres parámetros virales para distinguir entre lesiones de bajo y alto grado. En conclusión, aunque las lesiones con presencia de ADN viral mixto e integrado y expresión de E2 podrían estar en menor riesgo de progresión, y la carga viral y la integración se relacionaron con mayor gravedad de la lesión, su valor clínico como biomarcadores de LEIAG es limitado.

ABSTRACT It is important to distinguish among squamous intraepithelial lesions (SIL) those associated with increased risk cervical cancer. Our aim was to evaluate if the expression level of gen E2 in women with SIL and evidence of viral integration is associated to the grade of lesion. Cervical scrapes HPV16 positive from 19 women with normal histology, 45 women with low-grade SIL (LSIL) and 45 women with high-grade SIL (HSIL) were analyzed. Real-time PCR was used to quantify the mRNA of E2 and E2 and E6 genes to calculate viral load (E6) and the ratio E2/E6 to assess viral integration. Similar frequencies of E2 expression were found in LSIL and HSIL15/45 (33 %), the frequency in women without SIL was lower 3/19 (15.8 %), and all cases with E2 gene expression had mixed episomal and integrated viral DNA. The viral load increased significantly with the grade of SIL (ρ= 0.049), while E2/E6 ratio decreased (ρ=0.049). The ROC analysis showed low capacity of the three viral parameters analyzed to distinguish between low and high grade SIL. In conclusion although SIL with mixed and integrated viral DNA with E2 expression could be at lower risk of progression, and viral load and integration were associated with higher severity of the lesion, its clinical value as biomarkers of HSIL is limited.

Distribución de los genotipos del virus del papiloma humano en mujeres de Bogotá con anomalías en la citología cervicouterina / Genotype distribution of Human Papillomavirus in women from Bogotá with abnormal cervical smear

Objetivos: Determinar la distribución de los genotipos de VPH en mujeres de Bogotá con citología cervicouterina anormal. Métodos: Se colectaron muestras cervicales de 191 mujeres con ASCUS, 236 con lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LIEBG) y 116 de alto grado (LIEAG). La tipificación de VPH se realizó usando PCR con iniciadores consenso GP5+/GP6+ y reverse line blot. Resultados: La prevalencia de VPH fue 76,1%. Se observaron infecciones únicas en el 41,4% de las participantes, y coinfecciones en el 34,6%. La frecuencia de VPH según diagnóstico fue: 60,2%, 84,7% y 84,5% en ASCUS, LIEBG y LIEAG. Los VPH-16 y 58 fueron los tipos más frecuentes en los tres grupos, con frecuencias para VPH-16 de 20,4%, 33,9% y 38,8%, y para VPH-58 de 7,3%, 13,6%, 18,1% para ASCUS, LIEBG y LIEAG. En ASCUS y LSIL el tercer tipo en frecuencia fue VPH-56 (6,8% y 11,0%), mientras que en LIEAG fue VPH-18 (10,3%). Las infecciones con tipos virales probablemente oncogénicos y con tipos de bajo riesgo fueron mucho menos frecuentes y en general se presentaron como coinfecciones con tipos de alto riesgo. Conclusiones: Las infecciones con tipos de VPH de alto riesgo fueron las más frecuentes en todas las lesiones estudiadas, el VPH-58 ocupo el segundo lugar en frecuencia, como ha sido reportado en México y en general en Suramérica. El cambio hacia nuevas vacunas profilácticas que incluyan más tipos virales como el VPH-58 puede tener un mayor impacto en la disminución de la incidencia de lesiones preneoplásicas en nuestra región.

Objective: To determine the distribution of HPV genotypes in women from Bogotá with abnormal cervical smear. Methods: Cervical samples were collected from 191 women with ASCUS, 236 with low-grade (LSIL) and 116 with high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL). HPV typing was performed using consensus PCR primers GP5+/GP6 + and reverse line blot. Results: The prevalence of HPV was 76.1%. Unique infections were observed in 41.4% of the participants and co-infections in 34.6%. The frequency of HPV according to diagnosis was: 60.2%, 84.7% and 84.5% in ASCUS, LSIL and HSIL respectively. HPV16 and 58 were the more frequent types in the three groups, HPV16 frequencies were 20.4%, 33.9% and 38.8%, and HPV58 frequencies were 7.3%, 13.6%, and 18,1% for ASCUS, LSIL and HSIL respectively. The third type in frequency in ASCUS and LSIL was HPV56 (6.8% and 11.0%), while in HSIL was HPV18 (10.3%). Infections with probably oncogenic types or with low risk types were much less frequent and generally were observed as co-infections with high-risk types. Conclusions: Infections with high risk HPV types were the most frequent in all studied lesions, VPH-58 ranked second in frequency as has been reported in Mexico and in general in South America. The change to new prophylactic vaccines including more viral types as HPV58 could have a higher impact in reducing the incidence of pre-neoplastic lesions in our region.

Genotipificación de los factores de virulencia vacA y cagA de Helicobacter pylori en individuos de dos regiones de Colombia con riesgo opuesto de cáncer gástrico / Genotyping of Helicobacter pylori virulence factors vacA and cagA in individuals from two regions in Colombia with opposing risk for gastric cancer

Introducción. La prevalencia de infección por Helicobacter pylori es alta en Colombia; en la zona andina las tasas de cáncer gástrico son altas mientras que en las zonas costeras son bajas. Los genotipos de H. pylori cagA positivo y vacA s1 y m1 se asocian con un mayor riesgo de cáncer gástrico. Objetivo. Determinar las diferencias en las frecuencias de los genotipos de H. pylori asociados a virulencia en dos regiones de Colombia con riesgo opuesto de cáncer gástrico. Materiales y métodos. Se analizaron 401 biopsias del antro gástrico provenientes de 401 individuos con diagnóstico de gastritis no atrófica, gastritis atrófica o metaplasia intestinal; 256 se obtuvieron en la zona de alto riesgo (Tunja y Bogotá) y, 145, en la zona de bajo riesgo (Barranquilla, Santa Marta y Cartagena). La genotipificación de los genes de virulencia cagA y vacA se hizo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Resultados. No se observó diferencia en la frecuencia de infección por H. pylori entre las dos zonas (77,3 Vs . 77,9 %, p=no significativo, ns). La presencia de cagA fue mayor en la zona de bajo riesgo (77,9 Vs . 69,2 %, p=ns). El alelo vacA s1 también fue más prevalente en la zona de bajo riesgo (61,8 Vs . 72,0 %, p=ns). El alelo vacA m1 presentó mayor prevalencia en la zona de alto riesgo (57,2 Vs . 42,8 %, p=ns). La combinación cagA positivo s1m1 también fue más frecuente en la zona de bajo riesgo (48,9 Vs . 38,9 %, p=ns). Conclusiones. Las diferencias en el riesgo de cáncer gástrico en estas dos zonas no pueden explicarse por las diferencias en la prevalencia de infección por H. pylori o en la virulencia de las cepas circulantes.

Introduction: The overall prevalence of Helicobacter pylori infection is high in Colombia; however, in the country´s Andean region, gastric cancer rates far surpass those in coastal areas. Helicobacter pylori genotypes cagA positive and vacA s1 and m1 are associated with an increased risk of gastric cancer. Objective: To compare the distribution of H. pylori genotypes associated with virulence in two regions in Colombia with opposing risk for gastric cancer. Materials and methods: Four hundred and one gastric antral biopsies were obtained and analyzed from 401 individuals diagnosed with non-atrophic gastritis, atrophic gastritis and intestinal metaplasia: 256 came from the high-risk area cities of Tunja and Bogotá, and 145 from the low-risk area cities of Barranquilla, Santa Marta and Cartagena. Genotyping of virulence genes vacA and cagA was performed by PCR. Results: No difference was observed in the frequency of H. pylori infection between the two areas (77.3% vs 77.9 %, p=non significant, ns). The presence of cagA was higher in the low-risk area (77.9% vs. 69.2 %, p=ns). The vacA s1 allele was also more prevalent in the low-risk area (61.8 % vs 72.0 %, p=ns). The vacA m1 allele was more prevalent in the high-risk area (57.2 % vs 42.8 %, p=ns). The cagA positive s1m1 combination was also more frequent in the low-risk area (48.9% vs 38.9%, p=ns). Conclusions: The differences in the risk of gastric cancer in these two geographic areas cannot be explained by differences in the prevalence of infection by H. pylori or by differences in the virulence of circulating strains.

Lesiones preneoplásicas gástricas en pacientes colombianos: asociación de polimorfismos genéticos interleucinas 1B-511, 1RN, 10-819, 10-1082, factor de necrosis tumoral-&alpha -308 y anticuerpos inmunoglobulina G hacia cagA de Helicobacter pylori / Pre-cancerous gastric lesions in Colombian patients: association with IL-1B-511, IL-1RN, IL-10-919, IL-10-1082, TNF-&alpha -308 genes polymorphisms, and anti-Helicobacter pylori cagA IgG antibodies

Objetivo: Evaluar la asociación de los polimorfismos de alguna de las citocinas más estudiadas en relación con el cáncer gástrico (IL-1B-511, IL-1RN intron-2-VNTR, TNF-α-308, IL-10-819 e IL-10- 1082) y la presencia de anticuerpos hacia la proteína cagA de Helicobacter pylori con las lesiones preneoplásicas gástricas en pacientes colombianos. Materiales y métodos: Se estudiaron 185 pacientes con lesiones preneoplásicas (gastritis atrófca, metaplasia intestinal y displasia), y 154 controles (gastritis no atrófica), provenientes de hospitales de una zona de riesgo alto y otra de riesgo bajo para cáncer gástrico. Se obtuvieron biopsias gástricas y muestras de sangre; la genotipificación de los polimorfismos se hizo por discriminación alélica usando PCR en tiempo real y por PCR convencional y electroforesis en agarosa (VNTR del intron 2 de IL-1RN); la serología de Helicobacter pylori y Helicobacter pylori cagA se determinó por ELISA. Se utilizó regresión logística multinomial en el análisis estadístico. Resultados: El genotipo IL-1B-511TT (odds ratio = 4,05; intervalo de confianza 95% 1,35-12,10) se asoció a metaplasia intestinal; no se observaron otras asociaciones entre los diferentes polimorfismos y las lesiones preneoplásicas. La infección por Helicobacter pylori cagA positivo se asoció a gastritis atrófica, metaplasia intestinal y displasia (OR = 2,66; 13,70; 40,29, respectivamente). Conclusión: Los resultados sugieren que entre los genotipos proinflamatorios el genotipo IL-1B-511TT estaría asociado a la metaplasia intestinal, y la serología de Helicobacter pylori cagA positivo sería un biomarcador útil para intervenir y prevenir la presencia de lesiones preneoplásicas. Se necesitan otros estudios con población colombiana que evalúen la asociación hallada de IL1B-511 con la metaplasia intestinal.

Objective: To evaluate the relationship of some of the most studied cytokines (IL-1B-511, IL-1RN intron-2-VNTR, TNF-a-308, IL-10-819, and IL-10-1082) with gastric cancer, as well as the presence of anti-Helicobacter pylori cagA IgG antibodies with pre-cancerous lesions in Colombian patients. Materials and methods: A study was conducted on 185 patients with pre-cancerous lesions (atrophic gastritis, intestinal metaplasia and dysplasia), and 154 controls (non-atrophic gastritis), seen in hospitals in a high risk area, and another in a low risk area, for gastric cancer. Gastric biopsy specimens and blood samples were obtained. The genotyping of the polymorphisms was performed by allelic discrimination using real-time PCR, conventional PCR, and agarose electrophoresis (VNTR of IL-1RN intron 2). The serology of Helicobacter pylori and Helicobacter pylori cagA was determined by ELISA. A multinomial logistic regression was used in the statistical analysis. Results: The IL-1B-511TT genotype was associated with intestinal metaplasia (OR=4.05; 95% CI; 1.35-12.10). No other relationships were observed between the different polymorphisms and preimg/revistas/rcc/cancerous lesions. Infection due to a positive Helicobacter pylori cagA was associated with atrophic gastritis, intestinal metaplasia and dysplasia (OR=2.66; 13.70; 40.29, respectively). Conclusion: The results suggest that, among the pro-inflammatory genotypes, the IL-1B-511TT would be associated with intestinal metaplasia, and that a positive Helicobacter pylori cagA serology could be a useful biomarker for the intervention and prevention of pre-cancerous lesions. Further studies are required in the Colombian population in order to evaluate the relationship found between IL1B-511 and intestinal metaplasia.

Asociación de los polimorfismos IL-1B-511 e IL-1RN y Helicobacter pylori CagA positivo con cáncer gástrico en una zona de riesgo alto en Colombia / Association of interleukin-1 genetic polymorphism and CagA positive Helicobacter pylori with gastric cancer in Colombia

Background: There is an association of interleukin (IL)1B polymorphism with gastric cancer risk. However systematic reviews of the existing evidence have shown that such association varies across populations with different genetic ancestry. Aim: To evaluate the association of IL-1B-511 and IL-1RN polymorphism and Helicobacter pylori IgG antibodies CagA, with gastric cancer in two Colombian cities located in a high risk area for gastric cancer. Material and Methods: A case-control study including 46 gastric cancer cases and 99 controls with non-atrophic gastritis from a high risk zone for gastric cancer. Polymorphism genotyping was carried out by polymerase chain reaction (PCR) and IgG CagA status by ELISA. Results: IgG CagA seropositive individuals had an increased gastric cancer risk (odds ratio (OR) = 11.56; 95 percent confidence intervals (CI) 2.62-50.91 in Tunja and OR = 19.66, 95 percentCI 0.98-395 in Bogotá). IL-1B-511TT carriers in Tunja had increased risk of gastric cancer (OR = 11.31; 95 percentCI 1.20-106.54)), while IL-1RN*2 alelle carriers in Bogotá showed an inverse association with gastric cancer risk (OR = 0.03; 95 percentCI 0.01-0.65). Conclusions: This study adds evidence to the positive association of Helicobacter pylori CagA positive strains with non-cardial gastric cancer etiology. There is a possible heterogeneity in the association of IL-1B gene polymorphism with cancer, in populations of similar ethnic background and settled in the same risk area.

Polimorfismos genéticos de interleucinas IL-1B-511, IL-1RN, IL-10, factor de necrosis tumoral alfa-308 e infección por Helicobacter pylori CagA positivo en cáncer gástrico y úlcera duodenal en diferentes poblaciones en Colombia / Genetic polymorphisms of IL-1B-511, IL-1RN, IL-10 interleukins, tumor necrosis alfa-308 and Positive Helicobacter pylori CagA infection in gastric cancer and duodenal ulcer in different populations in Colombia

Objetivo: Determinar la asociación entre los polimorfismos IL-1B-511, IL-1RN, TNF-α-308, IL-10-819 e IL-101082 y la infección por Helicobacter pylori CagA positivo en un grupo de pacientes con cáncer gástrico y úlcera duodenal en diferentes poblaciones en Colombia. Métodos: Estudio de casos y controles con 341 pacientes: con gastritis no atrófica, 194; con cáncer gástrico, 58; úlcera duodenal con lesiones preneoplásicas, 54; y con úlcera duodenal, 35. La genotipificación de los polimorfismos se hizo por discriminación alélica usando PCR en tiempo real, y la del IL-1RN, por PCR convencional y electroforesis en agarosa. La infección por Helicobacter pylori CagA se determinó mediante ELISA. Se utilizó la regresión logística en el análisis estadístico. Resultados: Ser portador del genotipo IL-1B-511TT (OR=4,69; IC 95% 1,22-18,09) y tener una infección por Helicobacter pylori CagA positivo (OR=4,43; IC 95% 1,72-11,4) se asociaron a cáncer gástrico. Tener una infección por Helicobacter pylori CagA positivo (OR=4,39; IC95% 1,82-10,59) se asoció a la presencia de úlcera duodenal con lesiones preneoplásicas, y ser portador del genotipo IL-1B-511CT se asoció a úlcera duodenal (OR=0,30; IC 95% 0,10-0,91). Conclusión: Los resultados sugieren que la respuesta pro-inflamatoria y la genética virulenta de la bacteria son factores relacionados con los diferentes desenlaces ocasionados por la infección por Helicobacter pylori en la población estudiada; así, el polimorfismo IL-1B-511 es un factor relacionado con cáncer gástrico y úlcera duodenal, y la infección por Helicobacter pylori CagA positivo es un factor asociado a cáncer gástrico y úlcera duodenal con lesiones preneoplásicas.

Objective: To determine the association between the IL-1B-511, IL-1RN, TNF-α-308, IL-10-819 and IL-101082 polymorphisms and positive Heliocobacter pylori CagA infection in a group of patients with gastric cancer and duodenal ulcer in different populations in Colombia. Methods: A case-control study was performed on 341 patients: those with non-atrophic gastritis, 194; with gastric cancer, 58; duodenal ulcer with preneoplastic lesion, 54; and with duodenal ulcer, 35. The genotyping of polymorphisms was done with allelic discrimination using PCR in real time, and that for IL-1RN with conventional PCR and agarose electrophoresis. Helicobacter pylori CagA infection was ascertained with ELISA. Logistic regression was used in statistical analysis. Results: Being a carrier of genotype IL-1B-511TT (OR=4.69; CI 95% 1.22-18.09) and being positive for Helicobacter pylori CagA infection (OR=4.43; CI 95% 1.72-11.4) are associated with gastric cancer. Positive Helicobacter pylori CagA infection (OR=4.39; CI 95% 1.82-10.59) is associated with the presence of duodenal ulcer with preneoplastic lesions, being a carrier of genotype IL-1B-511CT is associated with duodenal ulcer (OR=0.30; CI 95% 0.10-0.91). Conclusion: The results suggest that pro-inflammatory response and virulent bacterial genetics are factors related to the different outcomes brought about by Helicobacter pylori infection in the population studied; that is, the IL-1B-511 polymorphism is a factor related to gastric cancer and duodenal ulcer, and positive Helicobacter pylori CagA infection is a factor associated with gastric cancer and duodenal ulcer with preneoplastic lesions.