Púrpura trombocitopênica trombótica: o papel do fator von Willebrand e da ADAMTS13 / Thrombotic thrombocytopenic purpura: the role of von Willebrand factor and ADAMTS13

A púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) instala-se de modo abrupto e é caracterizada pela oclusão difusa de arteríolas e capilares da microcirculação, levando à isquemia de tecidos. A oclusão é causada por microtrombos compostos basicamente de plaquetas e fator von Willebrand (FvW). O FvW é uma glicoproteína de estrutura multimérica sintetizada exclusivamente por células endoteliais e megacariócitos. Este fator promove a adesão das plaquetas ao endotélio lesado, participa do processo de agregação plaquetária e é a proteína carreadora do fator VIII na circulação. Em condições fisiológicas, os grandes multímeros do FvW encontram-se dentro das células endoteliais e nas plaquetas e não estão presentes no plasma. Tão logo estes grandes multímeros são liberados da célula endotelial, são clivados e removidos da circulação pela enzima ADAMTS13 (A Desintegrin And Metalloprotease with eight Thrombo Spondin-1-like). A deficiência funcional ou quantitativa de ADAMTS13 resulta no acúmulo de grandes multímeros de FvW no plasma, propiciando a agregação das plaquetas e oclusão difusa das arteríolas e capilares. A maioria dos casos de PTT está associada à deficiência da ADAMTS13 e já estão disponíveis no mercado internacional conjuntos diagnósticos para a determinação dos níveis de antígenos desta enzima, da de sua atividade e dos anticorpos anti-ADAMTS13. A avaliação laboratorial da ADAMTS13 parece constituir um avanço para o diagnóstico precoce da PTT. No entanto, a interpretação dos resultados exige cautela e um conhecimento do princípio do método, bem como das etapas das reações envolvidas.

Thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) starts abruptly and is characterized by diffuse occlusion of microcirculation arterioles and capillaries, leading to ischemia of tissues. Occlusion is caused by microscopic clots primarily composed of platelets and von Willebrand factor (VWF). VWF is a multimeric glycoprotein synthesized exclusively by endothelial cells and megakaryocytes. This factor promotes adhesion of platelets to injured endothelium, participates in the process of platelet aggregation and is the carrier protein of factor VIII in the circulation. In physiological conditions, large VWF multimers are present in endothelial cells and platelets and are not present in plasma. As soon as these large multimers are released from the endothelial cell, they are cleaved and removed from circulation by the ADAMTS13 enzyme. A quantitative or functional deficiency of ADAMTS13 results in the accumulation of large VWF multimers in the plasma and may result in the aggregation of platelets and diffuse occlusion of arterioles and capillaries. Most cases of PTT are associated with ADAMTS13 deficiency. The levels of antigens, activity and antibodies of MTS13 can be evaluated using internationally manufactured kits. The laboratory evaluation of ADAMTS13 appears to be a useful tool for the early diagnosis of PTT. However, interpretation of the results requires caution, as well as knowledge of the principles of the method and the steps of the reactions involved.

Avaliação da incidência das mutações G1691A no gene do fator V (fator V Leiden) e G20210A no gene da protrombina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 / Incidence of G1691A factor V gene (factor V Leiden) and G20210A prothrombin gene mutations in type 2 diabetes patients

Em virtude da alta prevalência de Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) na população mundial e da alta taxa de mortalidade decorrente de eventos trombóticos, é de extrema importância o conhecimento das alterações no sistema hemostático em pacientes portadores deste distúrbio. A mutação no gene do fator V (G1691A - fator V Leiden) em heterozigose ou homozigose confere aos portadores o fenótipo de resistência à proteína C ativada, situação que aumenta em sete vezes o risco de desenvolver uma trombose. A mutação G20210A no gene da protrombina resulta no quadro de hiperprotrombinemia, aumentando o risco de trombose em três vezes. A pesquisa dessas mutações de interesse em trombofilia é de grande relevância considerando que a presença das mesmas pode exacerbar o estado de hipercoagulabilidade acelerando as complicações no diabetes. O presente estudo teve como objetivo avaliar a incidência dessas mutações em indivíduos hígidos (Controle, n=16), pacientes com DM2 (n=7), com hipertensão (HAS, n=12) e com DM2+HAS (n=18), através da técnica de PCR-RFLP. As freqüências encontradas nos grupos estudados foram baixas e similares àquelas observadas na população brasileira em geral. Não foi possível estabelecer correlação entre a presença da mutação e características específicas de cada grupo. Dessa forma, ainda não está claro se há ou não uma maior prevalência dessas mutações em indivíduos diabéticos e se a presença das mesmas contribui para o aumento do risco de desenvolver trombose nesses indivíduos, sendo necessário estudos mais amplos para a elucidação da questão.

Because of the high prevalence of type 2 diabetes mellitus (DM2) worldwide and the high mortality rate due to thrombotic events, it is extremely important to know about changes in the hemostatic system of such patients. Factor V mutation (G1691A - factor V Leiden) in either heterozygosis or homozygosis confers the activated protein C resistant phenotype, which increases the risk of thrombotic events by a factor of seven. The G20210A mutation of the prothrombin gene results in hyperprothrombinemia, increasing the risk of thrombotic events by a multiple of three. These mutations are of great relevance considering that the presence of one or both can contribute to a hypercoagulability state accelerating complications in diabetes. The aim of this study was to evaluate the incidence of these mutations in controls (n=16), DM2 subjects (n=7), hypertensive subjects (HAS) (n=12) and DM2+HAS subjects (n=18). The frequencies found were low and similar to those observed in the Brazilian population in general. It was not possible to establish any correlation among mutations and specific features of each group. It is still not clear if there is or not a higher prevalence of these mutations in diabetic individuals or if the mutation contributes to an increase in the risk of thrombotic events in these individuals. Further studies involving a larger number of patients are necessary in order to answer these questions.

Otimização da técnica de citometria de fluxo para análise do fator tissular em monócitos de sangue periférico / Flow cytometric assay optimization for peripheral blood monocyte tissue factor analysis

A citometria de fluxo permite a análise individual de células quando há expressão de moléculas de membrana, produtos citoplasmáticos e nucleares. Quando se utiliza a marcação prévia das células com anticorpos monoclonais é possível estudar constituintes de membrana característicos de uma determinada linhagem celular. Assim, esta metodologia tem sido largamente utilizada, principalmente na área de onco-hematologia e dos transplantes de medula óssea. A possibilidade de se utilizarem dois ou mais anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos diferentes permite o estudo em uma determinada população celular de substâncias pró-coagulantes produzidas por células envolvidas nos mecanismos da hemostasia, abrindo-se a possibilidade de aplicação desta metodologia em áreas de estudo da fisiopatologia relacionada aos estados de hipercoagulabilidade. Os monócitos estão altamente envolvidos nos processos fisiopatológicos envolvendo a formação de trombo e placas ateromatosas, e o Fator Tissular (FT) consiste no principal ativador fisiológico do sistema de coagulação sangüínea. Monócitos estimulados ou não por lipopolissacárides de Escherichia coli expressam FT em condições fisiológicas normais. Neste trabalho buscou-se otimizar as condições de determinação da expressão de FT em monócitos por citometria de fluxo, a partir de metodologia já descrita, em duas populações de indivíduos sadios, com faixas etárias diferentes, no sentido de se estabelecerem os níveis de expressão de FT. Para a análise dos resultados foram utilizadas duas metodologias que definem o percentual de células expressando FT. Dos resultados obtidos, pode-se concluir que não há diferença significativa na expressão de FT de monócitos em função da idade e que os dois métodos de análise utilizados não diferem entre si

The development of the flow cytometric assay usingmonoclonal antibodies labeled with differentfluorescent substances enables the identification of aparticular cell population even if it is present inheterogeneous cell samples. This technique has beenapplied to oncohematology and bone marrowtransplantation studies. Two combined fluorescentmonoclonal antibodies enable the study of a particularcell population in the expression of procoagulantsubstances produced by cells involved in homeostaticmechanisms. The application of this methodologycreates the perspective of pathophysiologic studiesrelated to hypercoagulability states. Considering thatmonocytes are highly involved in pathophysiologicmechanisms contributing to thrombus formation andatheromatous plaques and that Tissue Factor representsthe principal physiologic activator of the clotting system,this study constitutes a potential tool for obtainingnew insights of the role of monocytes in diseasesassociated to hypercoagulability states. The present work aimed to establish the optimization of conditionsfor measuring the tissue factor expression in monocytesstimulated or not by lipopolysaccharides fromEscherichia coli and analyzed by flow cytometric assaybased on a previous methodology. Blood samples werecollected from healthy subjects and divided in two ageranges. Studies on monocytes were carried outcomparing two methods of analysis, which define thepercentage of cells expressing tissue factor on theirsurface. From the results, it was concluded that thereis no difference between the two age ranges related tothe tissue factor expression in monocytes. In addition,there were no significant differences between the twoassessed methods of analysis. Rev. bras. hematol.